收藏本站
收藏 | 论文排版

重组人白蛋白融合干扰素在毕赤酵母中的表达及稳定性研究

张伍魁  
【摘要】:目的 用电转化方法将线性化重组表达载体质粒pPIC9K-HSA-IFNα-2b转化整合入毕赤酵母宿主菌SMD1168,甲醇诱导表达出具有生物活性的目的蛋白,并对转化子表达条件及遗传稳定性进行初步研究。方法 提取重组表达质粒pPIC9K-HSA-IFNα-2b,小量限制性内切酶双酶切鉴定,鉴定后的重组质粒进行限制性内切酶Sal Ⅰ酶切线性化,纯化经单酶切线性化的重组表达质粒DNA并电转化巴斯德毕赤酵母菌(P.Pastoris)SMD1168。将阳性转化子进行PCR鉴定和Mut表型鉴定并用甲醇诱导表达,将表达上清进行Western-Blot鉴定,抗G418抗性鉴定及用酶联免疫吸附法(ELISA)测定融合干扰素的表达水平。Wish细胞-VSV病毒系统的细胞病变抑制法(CPE)测定表达蛋白的抗病毒活性及其效价。在摇瓶培养条件下,初步研究了甲醇诱导浓度及菌体诱导起始OD_(600)值两因素对转化子表达水平的影响。最后,对转化子基因及表达水平的遗传稳定性进行鉴定。结果 通过电转化方法成功将酶切线性化重组表达质粒DNA整合入宿主菌基因组,并在甲醇诱导条件下成功表达出具有生物学活性的目的蛋白。用酶联免疫法(ELISA)及Wish细胞-VSV病毒系统对目的蛋白的表达水平及抗病毒活性进行了测定,表达量和比活分别是300mg/L和1.1×10~7IU/mg。摇瓶条件下,通过对甲醇诱导浓度及诱导起始OD_(600)值两因素对转化子表达水平的影响的初步研究,我们发现:在0.5%~4.0%的范围,随着甲醇诱导浓度的升高蛋白表达量也升高,在其他因素固定时,菌体诱导起始OD值在5~80的范围内,随着OD值的升高表达量反而下降。同时,整合入转化子的基因还具有遗传稳定性。结论 酶切线性化重组表达质粒DNA的成功整合入宿主菌基因组及目的蛋白的成功表达和基因的表达遗传稳定性研究为大规模的发酵罐表达提供了保证。摇瓶条件下对转化子表达水平影响因素的研


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 张小娟;张荣光;段广才;范清堂;;乳酸乳球菌NZ3900电转化条件的优化[J];山东医药;2010年11期
2 张小娟;张荣光;;影响电穿孔法转化效率的因素[J];医学综述;2011年05期
3 单志英,徐海津,施兴启,聂舟,遇言,张秀明,白艳玲,乔明强,高才昌;铜绿假单胞菌最佳电转化条件的研究[J];遗传学报;2004年03期
4 王靖宇;李丽君;韩瑞发;;基因重组卡介苗高效电转化条件的实验研究[J];山西医药杂志;2010年01期
5 俞慕华,陈昭斌,黄锐敏,段永翔,陈辉,叶友松,詹希美;抗腮腺炎病毒抗体轻链基因的克隆及重组表达载体的构建[J];现代预防医学;2003年04期
6 俞慕华,黄文繁,姜立民,黄锐敏,温群文,戴传文,叶友松;抗腮腺炎病毒抗体Fab段基因的克隆及重组表达载体的构建[J];热带医学杂志;2003年02期
7 包其郁,孙永巧,王慧峰,包静月,徐微,徐祖元,杨焕明;影响电转化效率的几个因素探讨[J];温州医学院学报;2003年01期
8 周添;丰明乾;魏闻捷;谭仁祥;宋勇春;;Actin启动子的克隆及海洋丝状真菌Phoma herbarum YS4108的遗传转化(英文)[J];中国天然药物;2008年04期
9 刘建光;朱遂强;阎平建;李毅;;难治性癫癎患者中神经节苷脂GM1抗体和谷氨酸脱羧酶抗体的研究[J];中国康复;2006年05期
10 易珍;汤春园;徐明辉;李若林;丘晓云;黄军强;甘洁;李山;;乙型肝炎表面抗原弱阳性结果探讨[J];应用预防医学;2008年03期
11 李颖;;ELISA法检测儿童肺炎支原体感染结果分析[J];中国实用医药;2009年26期
12 刘华;王蕾;吴树英;骆铱洪;王隽;高锋;;ELISA检测592例乙肝表面抗原复检结果的分析[J];中国实验诊断学;2009年09期
13 林昭春;罗汉超;;酶联免疫吸附法在SLE血清学诊断方面的应用[J];国际皮肤性病学杂志;1989年02期
14 王龙虎;血清白喉抗毒素的测定:酶联免疫吸附试验与毒素中和试验的比较[J];国际生物制品学杂志;1990年01期
15 陈志群;原因不明的慢性肝病患者HCV核心抗体的血清阳性率[J];国外医学.内科学分册;1993年11期
16 潘桂枝;杨道科;宋振中;庆明轩;付保成;黄大鹏;赵卫星;苗健;;癌胚抗原、铁蛋白用于恶性肿瘤的联合测定[J];肿瘤基础与临床;1993年02期
17 沈心亮,谢云飞,李文辉,苏彩霞;表达乙肝病毒包膜中蛋白的嗜甲醇毕赤酵母菌株的构建[J];微生物学免疫学进展;1999年01期
18 陈雪岚,许杨,袁勇芳;赭曲霉毒素A的酶联免疫吸附法检测[J];卫生研究;2000年06期
19 孙业全;李绪斌;许福亮;李公宝;纪恩美;;肝细胞癌患者TACE介入治疗前后血清sICAM-1检测的临床意义[J];潍坊医学院学报;2005年06期
20 肖桂初;李振华;刘键;黄维加;;CGIA和ELISA诊断肝吸虫病的比较分析[J];中国热带医学;2006年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 金涛;;免疫性不育、不孕检测的临床意义[A];第一届全国不孕不育与生殖健康高级论坛(成都)论文集[C];2006年
2 阳幼荣;吴雪琼;张俊仙;梁艳;王兰;;化学发光法与酶联免疫吸附法检测血清抗结核抗体的比较研究[A];2011年中国防痨协会全国学术会议论文集[C];2011年
3 汪杨;牛俊奇;王峰;;RNA干涉抑制乙型肝炎病毒复制和表达的实验研究[A];中华医学会全国第九次感染病学学术会议论文汇编[C];2006年
4 张爱元;;慢性心力衰竭患者心功能与血浆Apelin水平的关系[A];中华医学会第11次心血管病学术会议论文摘要集[C];2009年
5 张会彩;刘聚祥;刘静;王建平;;动物饲料中呋喃唑酮的酶联免疫吸附检测法研究[A];京津冀畜牧兽医科技创新交流会暨新思想、新观点、新方法论坛论文集[C];2008年
6 吴劲松;马先雄;;PCR技术和酶联免疫吸附法诊断宫内感染的敏感性与可靠性比较[A];’96全国优生科学大会大会学术讲演与大会论文摘要汇编[C];1996年
7 白绿江;;ELISA法检测梅毒抗体的结果分析[A];第十届全军检验医学学术会议论文汇编[C];2005年
8 杜茜;何康来;王振营;石洁;董建臻;;华北地区穗期亚洲玉米螟为害与玉米穗腐病发生的关系[A];农业生物灾害预防与控制研究[C];2005年
9 金涛;;酶联免疫吸附法检测ADV,RSV,EBV,COXSAKIE抗体及其临床意义[A];第五次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2006年
10 周京国;郭晓兰;杨明辉;袁国华;魏锦;;suPAR在RA患者滑液和血浆中的临床意义[A];全国自身免疫性疾病专题研讨会暨第十一次全国风湿病学学术年会论文汇编[C];2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张海红;节杆菌电转化方法的优化及6-磷酸海藻糖酯酶基因的功能研究[D];兰州大学;2011年
2 时纪元;人工合成SHH蛋白N末端基因的Pichia酵母表达及其多克隆抗体制备[D];第二军医大学;2007年
3 刘增然;利用淀粉的酿酒酵母工程菌的构建[D];四川大学;2004年
4 于海文;原发性肝癌手术前后血浆HGF变化的临床意义及HGF甲基化寡核苷酸对肝癌细胞株BEL-7402作用的研究[D];山东大学;2004年
5 刘元;巴西固氮螺菌Yu62在玉米根部的定殖固氮芽孢杆菌的分离及其glnB基因的研究[D];中国农业大学;2005年
6 孟俊炜;BMP拮抗剂对远端肢芽骨骼发育影响的研究及中国汉族人群精神分裂症的关联分析[D];上海交通大学;2007年
7 郝俊光;低蛋白酶A啤酒酵母菌株构建的研究[D];江南大学;2007年
8 姚佳峰;侵袭性曲霉病患者动态监测血清半乳甘露聚糖的临床价值研究[D];中国协和医科大学;2009年
9 刘路宁;绿木霉(TRICHODERMA VIRENS)TY009菌株胶霉毒毒素分离纯化及绿色荧光蛋白标记研究[D];浙江大学;2008年
10 陈苏红;四种重要传染病病原体检测新技术研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张伍魁;重组人白蛋白融合干扰素在毕赤酵母中的表达及稳定性研究[D];安徽医科大学;2006年
2 张力;全局转录工程选育耐受乳酸产物的基因工程菌研究[D];华中科技大学;2011年
3 刘金艳;玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63转化体系的建立[D];河北农业大学;2007年
4 宋琳琳;可转化人工染色体(TAC)文库载体DNA制备的研究[D];首都师范大学;2006年
5 彭冉;抗铅联合苯酚降解多功能菌的构建[D];安徽农业大学;2010年
6 刘岩;灰霉菌GFP转化子致病力分析及其与小立碗藓互作体系的建立[D];华东师范大学;2011年
7 肖健康;大菱鲆hepcidin基因在巴氏毕赤酵母中的表达研究[D];四川农业大学;2007年
8 阙善进;黄绿青霉素人工抗原的制备及酶联免疫吸附法的建立[D];福建农林大学;2012年
9 王靖凯;嗜热乙醇杆菌遗传转化技术的研究[D];南京师范大学;2011年
10 黄春敏;整合基因扩增提高高温α-淀粉酶生产水平[D];江南大学;2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 陶义;挪威:把剩余风电转化成氢[N];中国煤炭报;2004年
2 榆林市委书记 周一波;建设文明富裕的新榆林[N];陕西日报;2003年
3 盟经委;“十五”期间我盟煤炭深加工取得历史性突破[N];锡林郭勒日报;2006年
4 记者  刘培现;做强做大非煤产业 推动资源型城市转型[N];大同日报;2006年
5 张俊杰 李寿利;郭家河井田开发项目启动[N];中煤地质报;2007年
6 时仲省 林恒大 刘春阳;急性胰腺炎治疗获突破[N];中国中医药报;2001年
7 重庆 马小杰;看懂UPS的广告[N];电脑报;2006年
8 邵春和 记者  王玮;我省四大块状经济发展加速[N];黑龙江日报;2006年
9 记者  刘仲平 鲁明智;榆林经济增速连续5年居全省之首[N];陕西日报;2007年
10 云南 严一泸;制作发电机的实验[N];电子报;2004年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978