芍药苷对小鼠日本血吸虫病肝纤维化信号转导通路的影响

【摘要】： 血吸虫病是人类主要热带病之一。血吸虫病主要死于肝虫卵肉芽肿以及继发性的肝纤维化。有研究显示,杀虫治疗后未成熟虫卵仍可继续发育,血吸虫虫卵肉芽肿反应仍在继续,而且,一旦肝纤维化达到一定程度,即使去除了肝纤维化诱因,纤维化仍将继续发展。因此,如何在肉芽肿形成阶段和肝纤维化早期,用药物干预以预防其发展,是杀虫治疗后第二个控制疾病发展的关键。然而至今无高效低毒的药物用于血吸虫性肝病的治疗。 目前已证实,肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)是分泌细胞外基质(extracellular matrix,ECM),引起肝纤维化最主要的细胞,转移生长因子β1(transforming growth factor beta1,TGFβ1)是其最强的促ECM分泌因子。但TGFβ1对血吸虫病肝纤维化的影响,目前仍有争议。 芍药苷(paeoniflorin,PAE)是从白芍中提取的主要有效成分。以往的研究发现,芍药苷具有免疫调节、抗炎等作用,但其在日本血吸虫虫卵肉芽肿和肝纤维化中的作用,国内外未见报道。 本课题用血吸虫尾蚴感染小鼠,制成血吸虫病肝肉芽肿和纤维化模型,考察PAE在体内对肝肉芽肿和纤维化以及TGFβ1的影响,然后在体外考察血吸虫可溶性虫卵抗原(soluble egg antigen,SEA)对小鼠腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophages,PMs)分泌TGFβ1的影响,以及TGFβ1和PAE对HSCs增殖和分泌胶原的影响。最后从基因和蛋白表达水平探讨PAE对TGFβ1-Smads信号转导通路的作用,以期了解PAE抗肝纤维化的部分机制。 目的:研究PAE对小鼠日本血吸虫病肝纤维化TGFβ1-Smads信号转导通路的影响 方法:用血吸虫尾蚴经皮肤感染小鼠,然后在感染后不同时间,分先后或同时给予吡喹酮和不同剂量PAE,用组织芯片HE染色和免疫组化技术了解PAE在杀虫不同时期对肝肉芽肿、肝纤维化形成和TGFβ1表达的影响;用SEA刺激PMs,分别用反转录多聚酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)、Western blotting以及酶联免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分析SEA和PAE对PMs产生TGFβ1的影响;用原位灌流-密度梯度离心法提取正常健康小鼠HSCs,经SEA刺激的腹腔巨噬细胞条件培养基(stimulated peritoneal macrophage-conditioned medium,Stimulated-PMCM)刺激HSCs后,用四甲基偶氮唑盐(methylthiazolyl tetrazolium,MTT)法和ELISA分别观察PMCM和PAE对HSCs增殖和分泌胶原的影响。我们选择稀释度为1:2的PMCM为最适浓度的巨噬细胞条件培养基(optimum macrophage-conditioned medium,OPMCM),然后,在OPMCM中加入抗TGFβ1单抗,以了解TGFβ1对HSCs增殖和胶原分泌的影响。最后,用RT-PCR和Western blotting分析PAE对HSCs中的Smads信号蛋白以及前胶原转录和合成的影响。 结果: 1.早期给予PAE可预防血吸虫病小鼠肝肉芽肿和肝纤维化的形成,降低肝内TGFβ1表达 感染血吸虫尾蚴后第12 d(在杀虫治疗前第30 d)开始给予PAE(30、120 mg/kg),能显著降低肝肉芽肿大小和肝纤维化程度,以及降低TGFβ1在肝组织中的表达,而在感染后第42 d(在杀虫治疗同时)或第72 d(在杀虫治疗30 d后)开始给予PAE则无上述作用。说明血吸虫感染后,早期给予PAE能预防肝肉芽肿和肝纤维化;同时也说明,肝纤维化可能与TGFβ1的表达有关。 2. SEA促进PMs分泌TGFβ1,而PAE抑制TGFβ1的分泌 ELISA、RT-PCR和Western blotting都显示SEA(0、2.5、5、10、20、40 mg/L)能刺激PMs分泌TGFβ1,且SEA在10 mg/L时能刺激PMs产生最大量的TGFβ1;同时,RT-PCR和Western blotting显示,PAE(0、7.5、15、30、60、120 mg/L)能浓度依赖性地抑制PMs产生TGFβ1。提示PAE抗肝纤维化的机制可能与其抑制PMs分泌TGFβ1有关。 3. PMCM及TGFβ1促进HSCs增殖和胶原分泌,而PAE抑制HSCs增殖及前胶原、胶原的转录、合成和分泌 MTT法和ELISA显示,不同稀释度的PMCM(1:32、1:16、1:8、1:4、1:2、1:0)对HSCs的增殖和I型胶原(collagen type I, Col I)、III型胶原(collagen type III, Col III)的分泌都具有促进作用。但稀释度为1:2和1:0的PMCM具有更大的效应。用抗TGFβ1单抗中和后的OPMCM其促进HSCs增殖和胶原分泌的作用明显下降,但与对照仍有差别,提示TGFβ1在HSCs增殖和胶原分泌中发挥一定的促进作用。同时,MTT法、ELISA、RT-PCR和Western blotting显示PAE(7.5、15、30、60、120 mg/L)能浓度依赖性地抑制HSCs增殖及I型α1前胶原(procollagen, type I, alpha1,Col Iα1)、III型α1前胶原(procollagen, type III, alpha1,Col IIIα1)、Col I和Col III的转录、合成和分泌。 4. PAE在转录和合成水平抑制HSCs中Smad3的表达 RT-PCR和Western blotting显示PAE对TGFβ1-Smads信号转导通路中的Smad2、Smad4和Smad7无明显作用,而对Smad3具有浓度依赖型性的抑制。提示,抑制Smad3转录和合成可能是PAE抗血吸虫病肝纤维化的机制之一。 结论: 1. TGFβ1可促进小鼠日本血吸虫病肝纤维化; 2.早期给予PAE可预防小鼠日本血吸虫病肝肉芽肿、肝纤维化的形成和TGFβ1表达; 3. SEA可刺激PMs分泌TGFβ1,后者可促进HSCs增殖和胶原分泌; 4. PAE预防血吸虫病肝纤维化可能与下述机制有关 a)抑制PMs分泌TGFβ1 b)抑制HSCs的增殖 c)通过抑制Smad3 mRNA的表达抑制HSCs产生胶原 总之,在血吸虫病肝纤维化中,SEA能刺激巨噬细胞产生TGFβ1,后者可使HSCs增殖和分泌胶原。PAE通过抑制巨噬细胞分泌TGFβ1、HSCs的增殖、Smad3的转录和合成而最终抑制胶原的产生,发挥其抗纤维化的作用。以上研究结果将为PAE开发成治疗血吸虫病肝纤维化中药新药提供了实验依据。