收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

Tau蛋白介导的细胞毒性及泛素连接酶Hrd1的保护作用

冯利杰  
【摘要】: Tau蛋白是神经细胞特有的微管相关蛋白,其功能是与管蛋白结合形成微管(microtubulin, MT),并维持其稳定性。而异常的tau蛋白聚集是许多神经退行性疾病共有的病理特征,这些疾病统称为tau蛋白病(tauopathy)。在tau蛋白病中,tau被高度磷酸化并形成成对螺旋丝(paired helical filaments, PHFs)结构,后者再聚集成神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)。Tau在某些状态下的代谢异常可能是tau聚集的原因,因此消除或减少细胞内非正常状态的tau应该是抑制tau的毒性和拯救细胞的可行策略。人类的Hrd1是新发现的一个内质网(endoplasmic reticulum, ER)膜定位的带有指环结构域(RING finger domain)的泛素连接酶(ubiquitin ligase, E3),能介导其特异性底物蛋白的泛素化和降解。我们的前期研究发现,AD病人的皮质和海马神经元内有广泛的Hrd1表达,并且与异常磷酸化tau的聚集存在负相关。本研究在神经和非神经来源的细胞模型上,观察了tau的过度表达和磷酸化对细胞形态、生长及分化的影响,同时也观察了Hrd1的表达对tau毒性的抑制作用,并初步探讨了Hrd1介导细胞保护作用的相关机制。这不仅有助于进一步认识Hrd1的功能和tau蛋白病的病理机制,也为以Hrd1为靶点的药物设计和筛选提供技术平台。目的: 观察tau的过度表达和磷酸化对细胞的形态、生长及分化的影响,同时也观察Hrd1的表达对tau毒性的抑制作用,并初步探讨Hrd1介导细胞保护作用的相关机制。 方法: 构建pEGFP-C1-tau真核细胞表达质粒。采用神经(SH-SY5Y)和非神经来源(293T)的细胞株,共转染pEGFP-C1-tau和表达野生型或酶失活型Hrd1等质粒,用GSK-3β诱导tau过度磷酸化,荧光倒置显微镜和激光共聚焦显微镜观察细胞形态的变化;MTT法检测细胞的增殖反应;western blot检测相关蛋白的表达;免疫荧光双标记法观察Hrd1和tau细胞内的共定位等。 结果: 1. Tau蛋白的过度表达和磷酸化对细胞形态,增殖与分化的影响采用SH-SY5Y和293T细胞,转染pEGFP-C1-tau质粒和pEGFP-C1空质粒。荧光和共聚焦显微镜观察发现瞬时转染pEGFP-tau质粒的细胞内,少量的融合tau蛋白表达不影响细胞的形态和活性,但过度的tau蛋白表达对细胞有毒性作用,包括细胞突起消失,胞体变圆,细胞内tau蛋白聚集,甚至细胞凋亡;并且细胞分裂受阻,可出现双核和多核,形成巨细胞。而稳定表达tau蛋白的细胞出现典型的凋亡特征:核固缩,体积缩小,核染色质边集,凝聚成大小不同的块,胞膜皱缩或出泡。共转染表达tau和GSK-3β质粒或用岗田酸(OA)诱导tau蛋白磷酸化后,细胞内GFP-tau的荧光强度明显增强,细胞形态更加异常。提示tau蛋白的过度表达对细胞有毒性作用,并且tau蛋白过度磷酸化后其毒性增加。 2.Hrd1的表达抑制tau介导的细胞毒作用 293T细胞共转染表达tau和野生型Hrd1的质粒,免疫荧光双标记结果发现,转染Hrd1的细胞形态基本正常,贴壁良好。而单独转染pEGFP-C1-tau质粒的细胞胞体变圆,突起变短或消失,贴壁性差等。共聚焦显微镜观察单个细胞内,当tau蛋白表达较少,Hrd1表达广泛时,细胞形态相对正常;而当细胞内出现大量的tau蛋白表达时,Hrd1的表达减少,此时细胞形态异常甚至失去细胞轮廓。细胞转染后4~5天,单独转染pEGFP-tau质粒的细胞出现了典型的凋亡特征。而稳定表达Hrd1和tau蛋白的细胞,形态相对正常,生长状态良好。提示Hrd1的表达能抑制tau蛋白介导的细胞毒性,促进细胞存活。 3.Hrd1的细胞保护作用依赖于E3的活性293T细胞共转染pEGFP-C1-tau和pcDNA3.1-Hrd1C1A(泛素连接酶活性缺失的Hrd1突变体)质粒,免疫荧光双标记结果发现,共转染细胞内tau蛋白表达量多,细胞形态更加异常。共聚焦显微镜观察单个细胞发现,虽然HrdC1A与tau在细胞内共定位,但不能阻止细胞形态的改变。而共转染表达野生型Hrd1和tau质粒的细胞,tau的表达明显减少,细胞形态基本正常。提示Hrd1的细胞保护作用依赖于它的E3活性。 4.Hrd1能降低293T细胞内tau的总体水平并且依赖于E3活性 293T细胞共转染pEGFP-tau和pCIneo-Hrd1(或pcDNA3.1-Hrd1C1A)质粒,24h后荧光倒置显微镜观察,与单独转染pEGFP-tau的细胞相比,共转染表达tau和野生型Hrd1质粒的细胞内GFP-tau荧光强度明显减弱;共聚焦显微镜观察发现,单个细胞内Hrd1表达多的部位,tau的聚集明显减少;而Hrd1C1A表达多的部位,tau的聚集无明显变化。Western blot结果也证实:Hrd1能降低细胞内tau蛋白的表达水平,而Hrd1C1A对tau蛋白的表达水平无明显影响。提示Hrd1能降低293T细胞内tau的总体水平并且依赖于E3活性。 5.Hrd1能降低293T细胞内磷酸化tau的水平 293T细胞共转染pcDNA3-GSK-3β和pEGFP-tau质粒,western blot结果显示GSK-3β呈剂量依赖性地诱导tau蛋白磷酸化,同时GSK-3β能增加细胞内tau蛋白的表达;Hrd1的表达能明显降低细胞内磷酸化tau蛋白的水平。提示Hrd1不仅能减少细胞内tau蛋白的表达,也能降低磷酸化tau的水平。 结论: 以上研究结果提示tau蛋白的过度表达和磷酸化对细胞有直接的毒性作用;Hrd1可能通过降低细胞内tau蛋白的水平来减少tau的毒性,从而保护细胞,并且该作用与Hrd1的泛素连接酶活性有关。由此推测:Hrd1的细胞保护作用可能是通过促进泛素依赖性tau蛋白降解而实现的。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 王志均;细胞保护与消化道损伤[J];北京医学院学报;1985年03期
2 周建国;吕柏宁;孟刚;李坪恋;左茂盛;;热应激下热休克蛋白70对细胞保护作用研究进展[J];西南国防医药;2009年05期
3 张建福;脑肠肽对消化道的细胞保护作用[J];国外医学.内分泌学分册;1984年03期
4 于宝蓉;山莨菪碱的细胞保护作用与钙拮抗[J];中国药理学通报;1992年04期
5 周迎春,陈镜合;心肌细胞保护作用的中药研究进展[J];中医药信息;2000年06期
6 王勤友,王潍,马京香,黄宗清;血液在磁场环境下保存对红细胞保护作用的研究[J];临床输血与检验;2002年02期
7 纪礼明;贾秉钧;;前列腺素的细胞保护作用[J];福建医学院学报;1984年01期
8 吴予平;李通;;前列腺素在消化系统中的细胞保护作用(文献综述)[J];国外医学.外科学分册;1985年04期
9 王志均;胃肠道的细胞保护[J];生理科学进展;1984年01期
10 唐承薇;;抗酸剂的细胞保护作用[J];药学进展;1992年03期
11 徐红,张国生,陈爱香,杨惠黄,窦宏亮;2%甲基纤维素液对兔眼角膜内皮细胞保护作用的实验研究[J];中国药学杂志;1995年04期
12 雷定和;尹友生;;促红细胞生成素潜在细胞保护作用的研究进展[J];右江医学;2009年03期
13 张建福;脑肠肽和消化道的细胞保护作用[J];徐州医学院学报;1984年02期
14 Guth PH;顾祥生;;粘膜涂层药和其他非抗分泌药:有无细胞保护作用[J];国外医学(消化系疾病分册);1988年02期
15 杨海涛;;抗酸剂和硫糖铝细胞保护作用的假定机制[J];国外医学(消化系疾病分册);1991年02期
16 魏辉,张荣汉,陈欣,王国斌,周运富;鼻泰对大鼠肥大细胞保护作用的实验研究[J];解放军广州医高专学报;1995年02期
17 刘甘泉,李晓君,冼超贵,王汉渝,利国威,古模发;黄芩中酚性甙类对小鼠颌下腺放射损伤的细胞保护作用[J];中药药理与临床;2000年01期
18 金政,李相伍,金美善,王启伟,朴丽花;蒲公英对体外培养心肌细胞保护作用的研究[J];中国中医药科技;2001年05期
19 邱丽颖;李英;范红斌;杨志勇;;阿司匹林对脑缺血-再灌注损伤不同时段的细胞保护作用[J];脑与神经疾病杂志;2006年04期
20 王在魁;苏联群;;丹参酮ⅡA对兔髓核细胞保护作用的实验研究[J];新疆医学;2009年10期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 尚喜雨;丁玉琴;刘萍;;谈胃的细胞保护作用[A];中南地区第六届生理学学术会议论文摘要汇编[C];2004年
2 郭一峰;周文丽;张建鹏;刘军华;冯伟华;焦炳华;;海螵蛸多糖对小鼠胃黏膜细胞保护作用的研究[A];2008年全国糖生物学学术会议论文摘要[C];2008年
3 魏锡云;张锦;陈肃标;孙劲旅;;扶正中药对小鼠免疫细胞保护作用的形态定量分析[A];第五届全国生物医学体视学学术会议、第八届全军军事病理学学术会议、第四届全军定量病理学学术会议论文汇编[C];2002年
4 初亮;邵荟竹;王帅;周琴;刘克辛;姚继红;;槲皮素对HepG2细胞二相酶的诱导及细胞保护作用的研究[A];第九届全国药物和化学异物代谢学术会议论文集[C];2009年
5 吴迪;闵伟;骆丹;;黄芩苷对UV损伤皮肤细胞保护作用的蛋白质组学研究[A];中华医学会第十五次全国皮肤性病学术会议论文集[C];2009年
6 谢建琼;方琴;王季石;胡秀英;崔欣;;人DNA修复基因MGMT导入NK细胞增强其抗药特性[A];贵州省2008年血液学年会论文汇编[C];2008年
7 范黎黎;尹蔚兰;唐小卿;;H2S对MPP~+损伤PC12细胞的拮抗作用及其机制[A];Proceedings of the 8th Biennial Conference of the Chinese Society for Neuroscience[C];2009年
8 陈晓宇;席加喜;;血栓通对顺铂损伤HK-2细胞保护作用及其机制的研究[A];2013年中国药学大会暨第十三届中国药师周论文集[C];2013年
9 曹莉;尹鸿操;周礼;王拥军;;氧化型低密度脂蛋白致PC12细胞的毒性作用[A];全国第三届心脑血管疾病学术会议论文集[C];2003年
10 闵伟;骆丹;;黄芩苷对紫外线辐射损伤人表皮细胞保护作用的差异蛋白质组学研究[A];2009全国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 陈亚红;细胞内NAD水平分析及多酶氧化体系抑制效应的研究[D];武汉大学;2004年
2 陈雪梅;细胞应激适应中HSP90的作用和应激适应保护蛋白的初步筛选[D];第一军医大学;2004年
3 冯惠茹;~(32)Pβ射线持续低剂量率照射肿瘤细胞的放射生物学机制及端粒酶的治疗监控和放射增敏价值基础研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2002年
4 杨绍楠;丁内酯衍生物对阿尔茨海默氏病细胞模型的作用及其相关分子机制的研究[D];山东大学;2012年
5 宫智勇;热休克蛋白70在苯并(a)芘致细胞DNA损伤修复中的作用[D];华中科技大学;2006年
6 徐益苗;热休克蛋白27及其磷酸化对p53的调控及介导MCF-7细胞多柔比星耐受的研究[D];南京师范大学;2013年
7 李新毅;雌激素对Aβ所致PC12细胞损伤保护作用的研究[D];华中科技大学;2006年
8 何志松;GATA-4加强MSCs细胞对梗死后缺血心肌细胞保护作用及其机制探讨[D];苏州大学;2012年
9 张晋渝;MicroRNA-155在T细胞耗竭中的作用及其机制研究[D];第三军医大学;2013年
10 贾欣;赭曲霉毒素A诱导人胃黏膜上皮细胞恶性转化及可能机制的研究[D];河北医科大学;2014年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 冯利杰;Tau蛋白介导的细胞毒性及泛素连接酶Hrd1的保护作用[D];安徽医科大学;2007年
2 马晨曦;重金属对HeLa细胞中热激蛋白70(HSP70)表达的影响[D];安徽农业大学;2013年
3 刘曼;多胺类化合物WJ01对PC12细胞拟缺血性损伤的保护作用及其机制研究[D];河南大学;2011年
4 李玉娟;ADMA对MPP~+损伤PC12细胞的拮抗作用及机制[D];南华大学;2010年
5 朱链链;齐墩果酸诱导A549细胞凋亡蛋白质组差异表达分析及细胞内外药物含量测定[D];重庆医科大学;2011年
6 刘海瑞;自体血液回收中硫酸镁对红细胞保护作用的研究[D];苏州大学;2007年
7 徐晓庆;兼具抗血小板聚集及内皮细胞保护作用的新型噻吩并吡啶类化合物的药理学研究[D];南京医科大学;2013年
8 李延红;NaNO_2预处理对过氧化损伤PC12细胞的保护作用[D];河南大学;2011年
9 杨洋;活性氧参与百草枯诱导的HL-60细胞毒及抗氧化剂的保护作用[D];兰州大学;2007年
10 陈容前;西地那非-H_2S释放剂(ACS6)对同型半胱氨酸损伤PC12细胞的拮抗作用及机制[D];南华大学;2011年
中国重要报纸全文数据库 前2条
1 本报记者 王丹;在围术期心脑保护领域书写历史[N];健康报;2012年
2 王建高;留学长才干报国正当时[N];科技日报;2004年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978