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LY3磷酸酶基因的原核表达及其单克隆抗体的初步制备

彭万仁  
【摘要】: 目的:在扩增、克隆人的LY3基因的基础上,构建相应的重组原核表达载体,原核表达含LY3的融合蛋白,并以此为免疫原,应用杂交瘤单克隆抗体技术制备LY3单克隆抗体,为将来进一步研究该基因的功能奠定基础。方法:根据LY3蛋白编码基因的序列,设计引物,PCR扩增LY3基因,通过限制性内切酶酶切、连接等亚克隆技术,利用pET-28a(+)质粒构建含LY3基因的原核表达载体,酶切、测序等鉴定,转化大肠杆菌后加IPTG诱导融合蛋白表达,SDS-PAGE分离表达的LY3蛋白,经Ni2+-NTA凝胶亲和层析纯化目的蛋白,用Western Blot方法检测重组蛋白的表达。以SDS-PAGE分离得到的融合蛋白为抗原,免疫Balb/c小鼠,利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体,并通过间接ELISA方法鉴定。结果:成功构建了含LY3基因的重组原核表达质粒pET-28a(+)-LY3,转化大肠杆菌经IPTG诱导后,Western Blot检测到LY3融合蛋白的表达。以SDS-PAGE分离得到的融合蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠,间接ELISA方法鉴定结果表明得到稳定的单克隆抗体。结论:成功构建出LY3原核表达载体并在原核细胞中表达成包涵体,以此作抗原免疫小鼠,成功制备出LY3单克隆抗体。为进一步研究LY3的生物学功能奠定基础。


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