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重组Sj-Ts4样蛋白在日本血吸虫病免疫诊断中的初步应用

潘丽红  
【摘要】: 目的:为了寻找血吸虫病新的免疫学诊断候选分子,在大肠杆菌中高效表达并纯化日本血吸虫sj-Ts4样融合蛋白,建立重组抗原间接ELISA方法(rSj-Ts4-ELISA)诊断日本血吸虫病。 方法:提取日本血吸虫成虫RNA,设计引物,用RT-PCR法扩增出日本血吸虫sj-Ts4样蛋白基因编码基因序列,T载体连接,再将其亚克隆入pGEX-5X-1载体中,经酶切、测序证实正确后,转化入大肠杆菌DH5α并用IPTG对该重组菌诱导表达,亲和层析分离纯化得到MW为58KD带有GST标签的重组Sj-Ts4样融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot验证表达量和免疫活性。后换用pET28a(+)表达载体,诱导表达得到MW为32KD带有HIS标签的重组Sj-Ts4样融合包涵体蛋白,将纯化、复性后的rSj-Ts4样蛋白和SjAWA包被反应板,确定其最适抗原包被量和血清稀释度,用rSj-Ts4-ELISA、SiAWA-ELISA和SEA-IHA方法平行检测34份急性、16份慢性和24份晚期血吸虫病患者血清;32份其他寄生虫病患者血清(24份华支睾吸虫病患者血清,8份钩虫病患者血清)以及30份正常对照者血清,比较不同方法之间敏感性,特异性以及交叉反应性。 结果:RT-PCR法扩增出一条大小约为819bp大小的sj-Ts4样蛋白的DNA片断,将其亚克隆表达质粒pGEX-5X-1,测序证实具有完整的ORF。诱导表达后,经SDS-PAGE可见一条约58KDa大小的GST融合蛋白条带,亲和层析法纯化出Sj-Ts4样蛋白,Western-blot显示Sj-Ts4样蛋白能够与抗GST特异性抗体反应。将目的基因转入表达质粒pET28a(+),同样经SDS-PAGE可见一条约32KDa大小的HIS融合蛋白条带。该融合蛋白为包涵体蛋白,经变性、纯化后,用复性的rSj-Ts4样蛋白作为抗原做ELISA、与SjAWA-ELISA和SEA-IHA方法平行检测急、慢性和晚期血吸虫病患者,华支睾吸虫病患者、钩虫病患者和正常对照者血清,结果显示:rSj-Ts4-ELISA和sjAWA-ELISA,对于上述34份急性血吸虫病患者血清检测的敏感性分别为97.1%和100.0%,经校正X~2检验无显著性差异(X~2=1.02,p>0.05);16份慢性血吸虫病患者血清,rSj-Ts4-ELISA和SjAWA-ELISA检测的敏感性分别为100.0%和100.0%,无差异;24份晚期血吸虫病患者血清,rSj-Ts4-ELISA和SjAWA-ELISA检测的敏感性分别为87.5%和75.0%,经校正X~2检验无显著性差异(X~2=1.23,p>0.05);30份正常人血清,两种检测方法的假阳性率分别为6.7%和3.3%,经校正X~2检验也无显著性差异(X~2=0.35,p>0.05);32份其他寄生虫病患者血清(华支睾吸虫病患者血清24份,钩虫病患者血清8份),rSj-Ts4-ELISA和SjAWA-ELISA检测的血清抗体的阳性率分别为12.5%和25.0%,经校正X~2检验无显著性差异(X~2=1.64,p>0.05)。rSj-Ts4-ELISA和SEA-IHA,对于34份急性血吸虫病患者血清检测的敏感性分别为97.1%和82.4%,经校正X~2检验无显著性差异(X~2=3.98,p>0.05);16份慢性血吸虫病患者血清,rSj-Ts4-ELISA和SEA-IHA检测的敏感性分别为100.0%和68.7%,经校正X~2检验有显著性差异(X~2=5.93,p<0.05);24份晚期血吸虫病患者血清,rSj-Ts4-ELISA和SEA-IHA检测的敏感性分别为87.5%和50.0%,经校正X~2检验有显著性差异(X~2=7.86,p<0.05);30份正常人血清,两种检测方法的假阳性率分别为6.70%和0.00%,经校正X~2检验无显著性差异(X~2=2.07,p>0.05);32份其他寄生虫病患者血清(华支睾吸虫病患者血清24份,钩虫病患者血清8份),rSj-Ts4-ELISA和SEA-IHA检测的血清抗体的阳性率分别为12.5%和9.4%,经校正X~2检验无显著性差异(X~2=0.10,p>0.05)。在实验室中rSj-Ts4-ELISA法诊断急、慢性和晚期血吸虫病,与SiAWA-ELISA法有着相似的敏感性、特异性,与SEA-IHA法相比在检测慢性和晚期血吸虫病患者血清中抗体的试验中重组抗原取得较好的敏感性。且本法操作简便,易于标准化。本研究rSj-Ts4样蛋白在诊断中的交叉反应少,表明rSj-Ts4样蛋白在血吸虫病免疫诊断上具有较大的应用潜能。 结论:本研究扩增克隆了Sj-Ts4样蛋白基因,在原核细胞中表达并纯化了Sj-Ts4样蛋白,以此rSj-Ts4-ELISA方法诊断日本血吸虫病。rSj-Ts4样蛋白制备简便,成本低廉,方法易于标准化,有可能更适合商品化生产和流行区血吸虫病的血清学辅助诊断。


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