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Grim-19在IFN/RA联合应用诱导卵巢癌SK-OV-3细胞株凋亡的机制研究

李敏  
【摘要】: 研究背景: 卵巢恶性肿瘤是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,难以早期发现,死亡率很高,严重威胁着妇女健康和生命,常规的手术及放化疗均难以明显提高患者的远期生存率,尤其是晚期患者的生存率,寻找新的治疗卵巢癌的方法迫在眉睫。人类基因组图谱的绘制以及人类基因组研究的蓬勃兴起,为从源头上防治恶性肿瘤提供了新的途径。近期的大量研究表明,人类基因组中与细胞增殖分化相关癌基因的激活和抑癌基因的失活与恶性肿瘤的发生、发展密切相关,在此基础上出现了对恶性肿瘤进行基因治疗的理论和实践探索。靶向基因治疗是通过分子生物工程手段使正常基因或治疗基因特异地作用于肿瘤细胞,抑制致瘤基因或修复缺陷基因,使肿瘤细胞生长受到抑制而不影响其他正常细胞。基因治疗在肿瘤领域的成功应用为卵巢癌基因治疗奠定了基础,靶向基因治疗已成为当今卵巢癌治疗的新趋势。 GRIMs(genes associated with retinoid-IFN-inducedmortality)是最近发现的一群参与干扰素(interferon,IFN)和维甲酸(retinoic acid,RA)合并诱导的细胞凋亡基因,是Kalvakolanu用反义RNA敲除技术在乳腺癌细胞中筛选鉴定并首先报道的凋亡蛋白。Grim-19属GRIMs家族成员,定位于19p13·2,该区的多种基因为前列腺癌的抑制基因。Grim-19是参与细胞线粒体的呼吸作用和调控细胞凋亡的新基因,参与IFN/RA诱导的肿瘤细胞凋亡,其异常的表达可能参与多种肿瘤的形成,例如在甲状腺Hurthle细胞腺瘤、肾细胞癌、前列腺癌、口腔癌细胞、结直肠癌等恶性肿瘤中GRIM-19均有异常的表达,该基因参与细胞的增殖、凋亡的调控过程,其表达的降低或者位点的突变可以导致STAT3的持续激活和表达升高,在卵巢癌的发病机制中STAT3信号转导通路的持续性激活至关重要,其激活有基质金属蛋白酶类、Bcl-2家族成员、血管内皮生长因子、Her2基因的参与,在肿瘤的细胞抗凋亡、血管重建、浸润转移、药物耐药等过程中起重要作用。因此,我们预选取浆液性卵巢癌组织检测GRIM-19及STAT3的表达,观察上皮性卵巢癌中凋亡基因GRIM-19及原癌基因STAT3发生怎样的变化;临床上ATRA和IFN联合应用于白血病,肝癌,乳腺癌,头颈癌,宫颈癌,外阴癌,肾细胞癌,卵巢癌,成神经细胞瘤等恶性肿瘤,另外有研究表明,GRIM-19过度表达可增加IFN/RA诱导的乳腺癌细胞凋亡率,Zhang等人在HeLa细胞分别转染pCMV-Tag-2B空质pCMV-GRIM-19,用IFN-β/RA处理细胞后,发现转染GRIM-19的细胞中约有82.5±3.6%的细胞发生了细胞凋亡,而对照组仅有42.4±2.6%的细胞发生了细胞凋亡。这表明GRIM-19的过表达有效地促进了IFN-β/RA诱导的细胞凋亡。因此,我们设想将GRIM-19转染至SK-OV-3细胞中,与SK-OV-3/Control对照,观察其对生物学特性的影响,从而为将来在临床上的应用提供理论和实验依据。 目的 研究全反式维甲酸(ATRA)联合干扰素-α(IFN-α)对SK-OV-3细胞(人卵巢癌细胞株)的生长抑制作用,并观察其对凋亡相关基因GRIM-19、原癌基因STAT3表达的影响,为上皮性卵巢癌的治疗提供理论依据及治疗线索。 方法 ①采用Q-PCR、RT-PCR以及免疫印记(Western blot)方法检测浆液性卵巢癌临床标本中GRIM-19、STAT3的mRNA、蛋白的表达;②采用MTT比色法观察在不同时间ATRA/IFN-α联合应用及单独应用对SK-OV-3细胞增殖率的影响;③荧光定量PCR(RT-QPCR)方法检测ATRA/IFN-α联合应用及单独应用GRIM-19mRNA的表达;④将高表达GRIM-19的重组质粒经脂质体转染到SK-OV-3中,经过嘌呤霉素筛选得到稳定转染的细胞株SK-OV-3/GRIM-19,并设立对照组SK-OV-3/Control,通过RT-QPCR和Western blot方法鉴定GRIM-19、STAT3的表达;⑤通过MTT法检测细胞株SK-OV-3/GRIM-19、SK-OV-3/Control细胞增殖情况以及对顺铂的敏感性。 结果 ①通过荧光定量PCR及RT-PCR检测浆液性卵巢癌在mRNA水平GRIM-19表达明显降低,STAT3表达增强;②Western blot检测浆液性卵巢癌组织在蛋白水平GRIM-19的表达降低,而STAT3的表达相应升高;③ATRA1uM联合IFN-α1b500u/ml作用于SK-OV-3细胞2d、4d、6d、8d与ATRA或IFN-α单独应用相比,MTT检测对细胞有显著的增殖抑制作用(P<0.05);④荧光定量PCR结果表明,ATRA/IFN-α两药合用在mRNA水平,与对照组和ATRA组、IFN-α组相比,GRIM-19表达增强,差异有显著性(P<0.05);⑤成功建立高表达GRIM-19的稳定转染的细胞株SK-OV-3/GRIM-19,并设立对照组SK-OV-3/Control,RT-PCR和Western blot结果显示在mRNA水平和蛋白水平GRIM-19的表达增强,STAT3的表达减弱,差异有统计学意义(p<0.05);⑥MTT检测结果显示SK-OV-3/GRIM-19组细胞增殖较SK-OV-3/Control明显下调(p<0.05);⑦对顺铂的敏感性研究:在DDP作用下SK-OV-3/GRIM-19细胞抑制率增强,在第6d抑制率达到48.76%,与对照组比较差异有显著性(p<0.05);联合IFN/RA后SK-OV-3/GRIM-19细胞抑制率显著增强,在第6d抑制率达到60.76%,与对照组比较差异有显著性(p<0.05)。 结论 ATRA/IFN-α联合应用可抑制SK-OV-3细胞的增殖并诱导其凋亡,其机制之一为上调GRIM-19表达,进而下调原癌基因STAT3的表达。


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