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基于IgY的ELISA用于日本血吸虫病循环抗原的诊断

周银娣  
【摘要】: 目的:从尾蚴感染42天后的新西兰大白兔中取肝脏,淘洗虫卵制备日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA),分别免疫新西兰大白兔和产蛋罗曼鸡,制备抗SEA的IgG和抗SEA的卵黄免疫球蛋白(IgY)。对制备的新型抗体IgY进行特异性鉴定,并用间接ELISA的方法进行滴度、耐热、耐酸、耐碱,耐胃蛋白酶等理化性质的研究。建立基于IgY的双抗体夹心ELISA体系(IgG-IgY ELISA体系),用于日本血吸虫病循环抗原的敏感性和特异性分析及进行疗效考核;同时用于肺吸虫、华支睾吸虫和钩虫感染者的交叉反应性分析。探讨IgY用于诊断日本血吸虫病的价值。 方法:购买阳性钉螺孵出尾蚴后,用玻片法以4500条/只感染新西兰大白兔,42天解剖肝脏淘洗虫卵,制备SEA保存备用。购买未经免疫的罗曼雏鸡饲养至5个月大小,开始产蛋后每只以150μg SEA对3只母鸡进行免疫,初次免疫后即开始收集鸡蛋,标记后放入4℃冰箱备用,制备纯化抗SEA的IgY,SDS-PAGE和Western blotting进行特异性分析,间接EILSA进行滴度和理化性质的检测;同时以SEA免疫新西兰大白兔制备抗SEA的IgG。建立以抗SEAIgG为捕获系统,抗SEA IgY为检测系统的双抗体夹心ELISA体系(IgG-IgY ELISA),棋盘滴定法确定最适包被抗体量、最佳血清稀释度、最佳检测抗体量,并比较板内板间差异,逐步优化建立的检测体系,用于日本血吸虫病循环抗原的诊断。共检测血清443份(急性血吸虫病患者血清68例,慢性血吸虫病患者180例,正常人100例,肺吸虫感染20例,华支睾吸虫感染48例和钩虫感染者血清27例),进行敏感性,特异性和交叉反应性分析。并对不同感染程度,吡喹酮治疗后不同时期小鼠血清进行检测。 结果:制备出浓度为300mg/L的SEA,SDS-PAGE检测IgY分子量与理论值一致,间接ELISA和Western blotting显示制备的IgY为抗SEA特异性的IgY,浓度为5.04mg/ml;滴度为1:1×105;耐热,温度80℃时5min不降解;耐碱,pH为8.5时,作用120min不降解;30%岩藻糖可以完全抑制在pH等于3时迅速降解,;37℃胃蛋白酶作用120min不降解。成功建立体系IgG-IgY ELISA,用于检测急性血吸虫病患者血清和慢性血吸虫病患者血清的阳性率分别为79.4%和64.4%,最低灵敏度为9.3ng/ml,检测正常人血清的特异性为92%,与肺吸虫、华支睾吸虫、钩虫患者血清的交叉反应性分别为20%,20.8%,14.8%。轻度感染(感染尾蚴5条/只小鼠)治疗后2个月,4个月,6个月,12个月的转阴率为15%,45%,90%,100%;中度感染组(感染尾蚴15条/只小鼠)治疗后2个月, 4个月, 6个月,12个月的转阴率分别为5%,25%,40%,70%;重度感染组(感染尾蚴35条/只小鼠)治疗后2个月, 4个月, 6个月,12个月的转阴率分别为0%,10%,30%,60%。 结论:本研究成功制备并鉴定了抗SEA的IgY,进行了理化性质的研究,成功建立且优化了IgG-IgY ELISA检测体系,用于正常人,急性血吸虫病患者血清和慢性血吸虫病患者血清的检测,以及肺吸虫、华支睾吸虫、钩虫患者血清的交叉反应性的分析,对感染血吸虫的小鼠进行了疗效考核,为血吸虫病的诊断提供了有效的辅助诊断方法。


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