核黄素光化学法灭活单采血小板悬液中病原体的实验研究及其对血小板活性影响的探讨

【摘要】： 目的(1)建立核黄素光化学法灭活病毒试验方法,探讨核黄素工作浓度与紫外线辐照剂量对灭活效果的影响。(2)探讨聚合酶链式反应(PCR)用于评价病毒灭活效果的可行性,探索病毒灭活评价的新方法。(3)观察PCR和细胞感染实验在评价核黄素光化学法对血小板中病毒灭活效果的一致性。方法:(1)以人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV AD169株)作为模型病毒,将病毒悬液和血小板按1:9比例混和,再分别加入终浓度为0,50,100,150及200μmol/L核黄素溶液,此时混和在血小板混悬液中HCMV的滴度为7.25±0.15logTCID50。含不同浓度核黄素的血小板病毒混悬液分别以辐照剂量为0,600,900,1200,1500及1800 mJ/cm2紫外光照射,按终点稀释法,在人胚成纤维细胞(HF)细胞长成单层的96孔细胞培养板上进行细胞对照、病毒对照、单纯核黄素对照、单纯紫外线对照及处理后样本病毒滴度的滴定,即以病毒细胞感染试验评价灭活效果,观察核黄素浓度以及紫外线辐照剂量对灭活效果的影响,根据正交试验原则选择最佳灭活条件。(2)根据HCMV的UL83保守区域设计2条引物,预期扩增病毒核酸长度分别是547bp和1505bp,提取核黄素光化学法灭活处理后血小板中的病毒核酸,以此作为PCR扩增的模板,进行非特异损伤后不同长度核酸片段(1505bp、547bp)的PCR扩增,同时与病毒细胞感染试验相比较,探讨核酸扩增技术对该灭活方法评价的可行性,以及病毒核酸扩增片段长度与病毒细胞感染性之间的关系。结果:(1)按照正交试验原则选择的最佳灭活条件为:工作浓度为150μmol/L的核黄素结合辐照剂量为1500mJ/cm2紫外光照射即可将滴度为7.25±0.15logTCID50的HCMV灭活至0.50 log TCID50。(2)当核黄素工作浓度为150μmol/L、紫外线辐照剂量1500mJ/cm2时,2条不同长度的HCMV核酸片段(547bp和1505bp)均能被扩增出来,而平行的细胞感染实验证明,处理后的HCMV仍具有感染性。当核黄素工作浓度为150μmol/L、紫外线辐照剂量≥1500mJ/cm2时,547bp片段在各处理组中扩增仍为阳性,但1505bp片段扩增为阴性,平行的细胞感染实验证明了所试病毒被完全灭活。(3)核黄素光化学法灭活病毒后,1505bp的核酸扩增结果与平行的细胞感染试验结果一致,说明用核酸扩增检测技术也可以评价核黄素光化学法灭活病毒的效果。结论(1)影响核黄素光化学法灭活病原体效果的主要因素为核黄素工作浓度及紫外线辐照剂量;(2)核黄素结合紫外光才可以有效灭活血小板中病毒;(3)PCR和病毒细胞感染试验一样能够反映某些灭活病毒方法的效果,它将有助于解决无细胞感染模型病毒灭活效果评价等问题,也可做为现有病毒灭活评价方法的补充,使其评价结果更加可靠。 目的(1)建立核黄素光化学法灭活细菌试验方法,探讨核黄素工作浓度与紫外线辐照剂量对灭活效果的影响。(2)研究核黄素光化学法处理对血小板生理和生化学指标的影响。方法(1)以大肠埃希菌作为革兰氏阴性菌的模型菌,表皮葡萄球菌作为革兰氏阳性菌的模型菌,将浓度为8.0logCFU/ml大肠埃希菌及表皮葡萄球菌菌液按1:100的比例分别加入血小板中,再加入终浓度为0,50,100,150及200μmol/L核黄素溶液至各份含菌的血小板,含不同浓度核黄素的菌悬液分别以强度为0,600,900,1200,1500及1800 mJ/cm2紫外光照射,以菌落计数计算处理后血小板含菌量,以正交试验原则选择最佳灭活条件。(2)以最佳灭活条件,分别处理含高浓度(6logCFU/ml)和低浓度(2logCFU/ml)模型菌的血小板,高浓度试验组处理后进行菌落计数,低浓度试验组处理后在血小板振荡仪放置5d后,用Bact/ALERT 3D系统进行监控,观察该方法灭活高、低细菌浓度的能力。(3)检测以最佳灭活条件处理后的含病毒/细菌的血小板及未处理血小板对照组的生理和生化学指标,观察处理前后的指标变化及各处理因素对上述试验结果的影响。结果(1)经工作浓度为150μmol/L核黄素结合紫外光1500 mJ/cm2处理后可对大肠埃希菌和表皮葡萄球菌达到有效灭活。(2)高浓度试验组处理后可将金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌灭活效率分别达99.9993%和100%。低浓度细菌灭活实验组,处理后放置血小板在振荡仪保存5d,然后用BacT/ALERT 3D微生物监测系统继续监控5d均为阴性。(3)经核黄素光化学法处理后的血小板生理和生化学指标略有改变,但和阴性对照比较P0.05。结论(1)影响核黄素光化学法灭活细菌效果的主要因素为核黄素工作浓度及紫外光辐照剂量,核黄素光化学法可以有效灭活血小板中细菌,Bact/ALERT 3D系统可以评价细菌灭活效果。(2)以最佳实验条件处理后,血小板的生理和生化指标活性有所下降,但均在不影响输注效果的可接受范围内。