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安徽省临床分离的肺炎克雷伯菌耐药性及新型质粒介导AmpC型β-内酰胺酶分子生物学特征

程君  
【摘要】:目的 了解2007年与2008年安徽省临床分离的肺炎克雷伯菌对16种抗菌药物的耐药性,以指导临床合理用药。 了解2008年安徽省临床分离肺炎克雷伯菌携带质粒介导AmpC型β-内酰胺酶基因型及其他耐药基因型,研究新AmpC型β-内酰胺酶的分子生物学特征及耐药特性。 材料与方法 菌株来源 收集安徽省细菌耐药性监控网中的34家不同级别医院2007年9月与2008年9月(每年9月1日到30日)从临床标本(去除同一病例相同部位重复分离的菌株)中分别分离出肺炎克雷伯菌180株与213株,采用全自动微生物分析仪对标本进行重新鉴定。 方法 采用2008年美国临床与实验室标准委员会推荐的琼脂平皿稀释法对2007年与2008年安徽省细菌耐药性监控中心网络医院收集的肺炎克雷伯菌进行对临床常用的16种抗菌药物进行药物敏感实验,并对药敏结果进行统计学分析。 对2008年收集的213株肺炎克雷伯菌采用头孢西丁纸片法试验筛选出产AmpCβ-内酰胺酶菌株,并对初筛阳性及可疑阳性的细菌,采用三维试验筛选高产AmpCβ-内酰胺酶株,对筛选实验阳性菌株与E. coli J53 (Azir)共孵,进行转移结合实验;采用琼脂平皿稀释法对野生株与接合子进行MIC测定。采用Southern Blotting试验再次验证新酶是否由质粒介导并定位其编码基因所在质粒大小。 对所有高产AmpCβ-内酰胺酶株菌株通过多重PCR扩增质粒介导ampC基因。对产质粒介导AmpCβ-内酰胺酶菌株用PCR方法检测超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因、1类整合子基因盒插入序列,以揭示其是否存在多种耐药机制;并采用热不对称交错PCR的方法,研究目的基因片段上下游序列,以了解整合子基因与目的基因的联系。 将多重PCR阳性的菌株行转移接合试验,并行全编码引物PCR扩增。对多次测序并经GenBank比对后确定的产新酶菌株进行以下实验:PCR扩增野生株和/或转移接合子中的AmpC型β-内酰胺酶编码基因片段,克隆入pUC-118载体,表达于感受态细胞E. coli JM109中,再次测定核苷酸序列,结果至GenBank比对,进行DNA序列分析。 将新酶全编码基因克隆入表达载体pHSG398,转化于感受态细胞E. coli JM109中,用加有抗菌药物的琼脂平板进行转化株筛选。用琼脂倍比稀释法对野生株、接合子与转化株同时进行MIC测定。 采用超声破碎法进行产新酶细菌转化株的粗酶提取,等电聚焦电泳测定其等电点(pI)。对粗酶纯化后,SDS-PAGE和考马斯蓝染色测定新酶分子量大小,进行酶促反应动力学研究,以初步了解新酶的动力学特性。 结果 通过对2007年与2008年安徽省临床分离的肺炎克雷伯菌的药敏结果发现对部分药物的药敏结果两年之间存在统计学差异,说明定期进行抗菌药物敏感性监测非常必要。 检出产质粒介导AmpCβ-内酰胺酶菌株14株(6.57%)。产酶菌株对16种常用抗菌药物,除亚胺培南、美罗培南全部敏感外,对其他大多数抗菌药物耐药率均高于非产酶株。14株产酶菌株中均表现为多重耐药,分别检测出各型β-内酰胺酶基因,并且9株扩增出1类整合子基因盒插入序列。 对213株肺炎克雷伯菌用多重PCR检测质粒介导ampC基因,有14株阳性,再分别用单对引物对阳性株进行PCR扩增,结果显示:blaDHA阳性8株,blaEBC阳性4株,blaCIT阳性2株。 对14株产酶菌PCR产物的测序结果进行BLAST分析,发现有1株为新的质粒编码ampC基因型,其基因序列均已提交GenBank,获得的登录号分别为:FJ237367,其中一株所产新酶经Jacoby GA同意并命名为MIR-5。 产新型质粒介导AmpCβ-内酰胺酶菌株的转移接合试验和克隆表达试验均取得成功,其野生株、接合子及转化株的MIC结果显示:野生株和接合子有着几乎相同的耐药谱,而转化株对部分药物的敏感性较前两者明显下降。 产新型质粒介导AmpCβ-内酰胺酶细菌转化株的等电聚焦及SDS-PAGE结果显示,其等电点在9.01左右,蛋白质分子量约为41kDa。Southern Blotting试验再次证实了新酶由质粒介导并定位其编码基因位于约57Kb大小的质粒。通过对编码新酶基因上下游序列的分析,目的基因的上下游不存在典型的整合子结构。 酶促反应动力学研究,初步了解新酶对6种常用抗菌药物的Km值和Vmax值,结果显示:该酶对头孢他啶的水解效率最低。 结论 本地区产质粒介导AmpCβ-内酰胺酶肺炎克雷伯菌对临床常用抗菌药物的耐药率均较高,多重耐药现象普遍,且同时存在多种耐药机制,其中以产生灭活酶和1类整合子介导的耐药机制为主。对产酶株临床经验用药可选用碳青霉烯类、阿米卡星、四代头孢菌素类抗菌药物。 本地区质粒介导AmpCβ-内酰胺酶以CIT,EBC,DHA型为主。对全编码基因序列比对分析后,发现了1种新型质粒介导AmpCβ-内酰胺酶(MIR-5, GenBank基因序列号为FJ237367),此种酶是首次在国内外被报道。产酶菌株的耐药性可通过质粒在不同菌株之间传递,因此有必要加强本地区产质粒介导AmpCβ-内酰胺酶菌株的监测,这对于阻止耐药基因的传播与细菌耐药性控制具有重要的流行病学意义。


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1 中南大学湘雅医院感染控制中心主任 吴安华;抗菌药物的发展与细菌耐药[N];中国医药报;2004年
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