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人PTP1B克隆表达及豹皮樟总黄酮治疗2型糖尿病大鼠部分机制的研究

鲁云霞  
【摘要】: 蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)属于蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTPs)家族,以跨膜受体样蛋白和胞内酶2种形式存在,催化蛋白质的磷酸化酪氨酸残基的去磷酸化反应,是哺乳动物体内最早被鉴定、纯化的PTPs[1,2]。PTP1B作用于胰岛素受体(IR),胰岛素受体底物1、2(IRS-1,IRS-2),生长因子受体结合蛋白2(Grb2),磷脂酰肌醇3激酶(PI-3K)等与胰岛素信号转导相关的蛋白,使它们的磷酸化酪氨酸残基脱磷酸,衰减胰岛素信号转导,从而产生受体后的胰岛素抵抗[3]。最近有人向小鼠的肝细胞瘤中导入针对PTP1B的siRNA,结果发现胰岛素信号转导增强[4],再次证实了PTP1B在胰岛素信号通路中的作用。 PTP1B的高表达除了引起胰岛素抵抗外还可引起瘦素抵抗,从而引发2型糖尿病(T2DM)及肥胖[5,6]。PTP1B基因敲除鼠不仅胰岛素敏感性增强,而且去除了PTP1B对胰岛素和瘦素信号转导的抑制,使小鼠在高脂饮食条件下也不发生肥胖,且发育良好,具有正常的繁殖能力,癌症的发生率也未见提高[7],这提示了PTP1B作为胰岛素信号通路的主要负调控因子,其小分子抑制剂可能是有效的抗糖尿病/肥胖症药物,而且不产生副作用。事实上PTP1B抑制剂已成为胰岛素增敏剂的候选药物之一[8],全世界有不少实验室正在从天然中草药或人工合成的药物中以PTP1B作为靶点筛选高特异性的抑制剂。 PTP1B与肥胖症、T2DM和肿瘤关系密切[7],因此它的大规模诱导表达对研究这些疾病有着重要的意义。本研究将PTP1B基因作为T2DM合并肥胖症的重要候选基因,结合豹皮樟总黄酮(TFLC)对T2DM大鼠模型的疗效及降糖机制研究,为TFLC应用于临床治疗肥胖合并2型糖尿病提供前期试验依据。主要研究内容包括以下四个方面: 1.人PTP1B基因cDNA全长的克隆和原核系统表达 取2型糖尿病人(BMI28kg·m-2)外周抗凝静脉血,用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞,提取总RNA,以Oligo dT为引物,合成出cDNA第一链。以逆转录(RT)产物为模板,PCR扩增出PTP1B插入片段,连接入克隆载体pMD-18T Vector中构建pMD-hPTP1B。设计带酶切位点(BamHⅠ,EcoRⅠ)的引物,以pMD-18T Vector作模板进行亚克隆,双酶切后构建原核表达载体pET28a(+)-hPTP1B,氯化钙法转化入BL21(DE3),IPTG诱导表达并对诱导剂的浓度、时间及诱导温度等条件进行了优化。从2型糖尿病患者外周血中扩增得到1301bp PTP1B cDNA全长序列,经双酶切鉴定及测序分析,表明已成功构建了原核表达载体pET28a(+)-hPTP1B;IPTG的最适诱导浓度为0.05 mmol·L-1,最适诱导时间为5 h,最适诱导温度为37℃;Western blot表明表达的重组融合蛋白具有与天然hPTP1B相同的结合抗体活性。 2. rhPTP1B蛋白的分离纯化、酶活性测定以及抑制剂实验 亲和层析法纯化rhPTP1B,复性后用于酶活性测定及抑制剂的实验。取细菌裂解上清液经Ni2+亲和层析柱纯化后,利用PTP1B水解特异性底物4-硝基苯基磷酸二钠盐(pNPP-Na2)的磷酸基团而产生颜色反应来测定rhPTP1B的活性,分析其与rhPTP1B浓度、底物浓度及反应温度的关系,确定钒酸钠(Na3VO4,VAN)的抑制类型和豹皮樟总黄酮(TFLC)对rhPTP1B的抑制作用和浓度依赖关系,并研究2型糖尿病常用治疗药物吡格列酮和二甲双胍对rhPTP1B有无抑制作用,探讨其有无新的降血糖机制。结果表明诱导表达纯化的rhPTP1B融合蛋白可用于抑制剂的研究:1.rhPTP1B活性随酶浓度及底物浓度的增加而增加;2. 35℃时rhPTP1B的活性最大;3.VAN的抑制作用呈浓度依赖性增强,可能为非竞争性抑制作用;4.TFLC对rhPTP1B有明显的抑制作用;5.治疗2型糖尿病的常用药物二甲双胍和吡格列酮对PTP1B酶并无明显抑制作用,说明这两种药物不是通过对PTP1B的抑制起作用的。 3.人PTP1B基因的真核系统表达及在HepG2细胞的胰岛素信号通路中的作用 构建真核表达载体pcDNA3.1-hPTP1B,电穿孔法转染至人肝癌HepG2细胞,G-418筛选2周后得到稳定转染的细胞株,检测rhPTP1B在转录水平和翻译水平的表达,免疫荧光法确定表达的rhPTP1B主要定位在细胞浆,MTT法初步研究rhPTP1B可能对细胞增殖和细胞周期无显著影响,免疫沉淀法结合Western blot检测其对IRS-1、IRβ的去磷酸化作用,结果表明rhPTP1B可显著减少IRS-1、IRβ的磷酸化程度,即明显衰减胰岛素刺激时胰岛素的信号转导通路;构建了真核沉默载体pBI-dsPTP1B,瞬时转染HepG2细胞,Western blot检测PTP1B的被抑制表达可达约50%。 4.新型2型糖尿病大鼠模型的建立、TFLC的治疗及与PTP1B表达的关系 用高糖高脂乳剂灌胃雄性SD大鼠5个月,小剂量STZ注射构建T2DM模型,分别给予TFLC (400mg/kg)和阳性对照药钒酸钠(VAN,10mg/kg)灌胃治疗6周,观察疗效。结果表明:糖尿病大鼠经TFLC治疗后空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、胰岛素(FINS)、游离脂肪酸(FFA)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL-C)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)显著下降,高密度脂蛋白(HDL-C)和胰岛素敏感指数(ISI)明显提高,胰岛β细胞显著增生,肝匀浆丙二醛(MDA)含量下降,超氧化物歧化酶(SOD)活性升高;肾、心肌和肝脏的病理学明显改善。RT-Real time PCR、Western blot结果表明T2DM组靶组织中PTP1B的表达明显升高,TFLC组中PTP1B的表达明显降低。与VAN相比,TFLC可明显降低血糖和血脂,减轻肝脏组织的自由基氧化应激,其改善胰岛素抵抗,可能与其显著促进胰岛β细胞的增生,明显降低靶组织中PTP1B的表达,增强胰岛素信号通路有关。


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