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巯基烷基化壳聚糖介导共表达质粒pIRES-hVEGF_(121)cDNA/hBMP4体外转染的研究

卢迪  
【摘要】: 目的:以新型巯基烷基化壳聚糖(TACS)为载体介导重组共表达质粒pIRES-hVEGFl2lcDNA/hBMP4体外转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),探讨TACS用作骨组织工程中基因载体的可行性,为进一步研究骨缺损的联合基因治疗提供实验基础。 方法:全骨髓培养法分离、培养大鼠MSCs ;真核共表达质粒pIRES-hVEGFl2lcDNA/hBMP4经酶切鉴定后,复凝聚法制备TACS-基因纳米粒,用透射电镜对其形态和粒径进行观察和表征,凝胶阻滞分析其对基因的保护情况;将纳米粒转染第3代大鼠MSCs,并设壳聚糖组、脂质体组、及裸质粒组分别为实验对照、阳性对照及阴性对照,噻唑蓝(MTT)法比较不同基因载体细胞毒性的差异;分别于转染后3,4d提取MSCs的总RNA、总蛋白,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测目的基因的表达情况。 结果:全骨髓培养法可获得大量MSCs并具有活跃增殖能力;共表达质粒经酶切鉴定,与预期结果相符;TACS/pDNA复合纳米粒形态不很均一,平均粒径约264nm;凝胶阻滞分析证明TACS能有效地包裹和保护共表达质粒不受DNaseⅠ酶的消化;对转染后各组MSCs相关指标检测显示,TACS组细胞存活率(73.18±6.56)%,明显高于脂质体组(45.92±4.93)%(P0.01);除阴性对照组外, RT-PCR和Western blot均检测到转染后MSCs中hVEGF121及hBMP4的表达,对Western blot所得条带的灰度值相对半定量分析表明,TACS组目的蛋白表达量低于脂质体组(P0.05),但明显高于壳聚糖组(P0.01)。 结论:共表达质粒pIRES-hVEGFl2lcDNA/hBMP4在TACS介导下成功转染大鼠MSCs并获得表达。TACS细胞毒性小,且较未改性壳聚糖转染效率有明显提高。


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