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老鹰茶总黄酮中黄酮类单体对TGF-β1诱导的肝星状细胞增殖的影响及部分机制研究

周维晨  
【摘要】: 肝纤维化是一种严重危害人类健康的疾病,是细胞外基质(Extracellur matrix, ECM)合成和降解失衡,引起过多的ECM在肝脏沉积所致。肝星状细胞(Hepatic stellate cells, HSC)的激活、增生、转化是肝纤维化的中心环节,其中活化的HSC大量增殖和胶原的过度生成是导致ECM大量沉积的重要原因。 老鹰茶,又名豹皮樟,系樟科木姜子属毛豺皮樟(Litsea coreana leve)的叶,其中黄酮类成分是老鹰茶的主要成分。药理学实验证明老鹰茶总黄酮(Total flavonids of Litsea coreana L, TFLC)具有抗氧化、降糖、降脂、抗肝纤维化、抗炎及免疫调节等功效。本课题组前期分离出四个黄酮苷类化合物,分别为:槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(I)、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷(II)、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅲ)、山柰酚-3-O-β-D-半乳糖苷(IV)。因此,本实验通过探讨黄酮类单体是否能通过调节TGF-β1来改善肝纤维化,从而进一步了解老鹰茶总黄酮抗肝纤维化的作用机制。具体研究内容包括以下两个部分: 1.老鹰茶总黄酮中四种黄酮类单体的提取与分离 以黄酮含量为评价指标,采用L9(33)正交试验对老鹰茶总黄酮水提取工艺进行优化,结果优化的生产工艺为用12倍量水提取3次,每次1小时。本文采用非极性的D101型大孔吸附树脂纯化老鹰茶总黄酮,采用该工艺纯化TFLC后,紫外分光光度法测定总黄酮回收率90 %,平均纯度为48.59%。本文采用正、反相硅胶色谱法反复对老鹰茶总黄酮进行分离,分别得四种黄酮类化合物,经与已知化合物比较,鉴定为:槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-β-D-半乳糖苷和山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷。 2.黄酮类单体对TGF-β1诱导的肝星状细胞增殖的影响及部分机制的研究 本文采取肝脏灌流来分离出正常大鼠的肝星状细胞,并进行培养。此法分离的肝星状细胞得率为2×107/肝,细胞活力及纯度都在90%以上。MTT法检测四种黄酮类单体对HSC增殖的抑制作用,结果发现,四种黄酮类单体在培养24、48及72h时均对HSC的增殖具有不同程度的抑制作用,且山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷在培养48h时对HSC的增殖的抑制作用最强。RT-PCR法检测山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷对TGF-β1诱导的HSC中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Smad2、Smad3及Smad7中mRNA的表达的影响,结果发现,能够明显下调HSC的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Smad2及Smad3中mRNA的表达,上调Smad7 mRNA的表达。


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