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呼吸道合胞病毒感染巨噬细胞活化Toll样受体3、Toll样受体7介导的抗病毒作用研究

史晓佾  
【摘要】: 目的:探讨呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染巨噬细胞(RAW264.7细胞)后,Toll样受体3(Toll-like receptor 3, TLR3)及Toll样受体7(Toll-like receptor 7, TLR7)的水平变化,初步研究TLR3和TLR7活化在RSV感染中介导产生的I型干扰素(interferon,IFN)抗病毒作用及其可能的调控机制,为临床RSV感染的预防与治疗上提供新的思路。 方法:RSV感染体外培养的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞,预先分组给予TLR3或TLR7特异性抗体处理,分别于不同时间点(4h、8h、12h、16h和24h)收集各组细胞及细胞培养上清,并以未感染病毒的细胞为对照组。①用Trizol提取细胞总RNA,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测TLR3、TLR7、干扰素调节因子3(Interferon regulatory factor 3,IRF3)、干扰素调节因子7(Interferon regulatory factor 7,IRF7)、干扰素α(IFN-α),干扰素β(IFN-β),RSV融合蛋白基因(F基因)的mRNA表达量变化;②用免疫印迹(western blot)法检测TLR3及TLR7蛋白的表达变化;③用酶联免疫(ELISA)法检测细胞培养上清中IFN-α、IFN-β的表达变化;④用MTT四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组细胞存活率及病毒抑制率变化;⑤空斑形成实验(plaque forming unit,PFU)测定各组不同时间点的病毒复制滴度。 结果:①在mRNA转录水平,感染组上调TLR3、TLR7、IRF3、IRF7、IFN-α、IFN-β、RSV F基因;在给予TLR3抗体组,虽上调TLR3、IRF3、IFN-α、IFN-β的表达,但表达量都比感染组同时间点下降,且下降有统计学意义,TLR7、IRF7、RSV F基因较RSV感染组升高;在给予TLR7抗体组,虽上调TLR7、IRF7、IFN-α、IFN-β的表达,但表达量都比感染组同时间点下降,且下降有统计学意义,TLR3、IRF3、RSV F基因较RSV感染组升高;②在蛋白水平,感染组上调TLR3、TLR7蛋白的表达;在给予TLR3抗体组,未检测到特异性蛋白条带;在给予TLR7抗体组,TLR7蛋白表达量比感染组同时间点显著下降;③R SV感染RAW264.7细胞后,上调细胞培养上清中IFN-α和IFN-β的分泌量;给予TLR3抗体组,细胞培养上清中IFN-α和IFN-β的分泌量也随感染时间的延长而含量增加,但IFN-β较RSV感染组显著降低;给予TLR7抗体组,细胞培养上清中IFN-α和IFN-β的分泌量也随感染时间的延长而含量增加,但IFN-α较RSV感染组显著降低;④给予TLR3抗体组及给予TLR7抗体组,细胞存活率均较RSV感染组下降,给予TLR3抗体组较给予TLR7抗体组病毒抑制率均有统计学差异;⑤RSV感染RAW264.7细胞后,病毒随时间的延长上调复制滴度;给予TLR3抗体组与给予TLR7抗体组的病毒复制滴度都较感染组高,且给予TLR3抗体组较给予TLR7抗体组病毒复制滴度更高。 结论: RSV感染RAW264.7巨噬细胞后可上调TLR3、TLR7表达,其活化后介导产生的I型干扰素在一定程度上可抑制病毒的增殖水平,通过分别抑制TLR3及TLR7后,I型干扰素含量及细胞存活率的降低,RSV F基因及病毒滴度的上调,都说明了RSV感染中IFN引起的抗病毒免疫机制与TLR3及TLR7的转导途径有关,并且以TLR3途径为主,而IFN-β是由TLR3诱导产生的最主要I型干扰素, IFN-α是由TLR7诱导产生的最主要I型干扰素。


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