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ITGAM和FcγRIIIA与系统性红斑狼疮发病相关性的分子流行病学研究

李连红  
【摘要】: 背景 系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一种全身性自身免疫性疾病,病变常累及多系统多器官。患者最突出的表现是血清中出现大量多种自身抗体,导致免疫复合物沉积和补体激活,引起多个系统和器官的损害。SLE的病因和发病机制十分复杂,一般认为是遗传与环境等多种因素共同作用引起机体免疫功能的紊乱,产生多种免疫异常。目前通过连锁分析和全基因组关联研究(Genome-Wide Association Study, GWAS)方法,已确定20多个基因与SLE显著相关。这些基因的功能主要涉及三种生物学过程:①免疫复合物处理;②Toll样受体及I型干扰素通路;③免疫信号转导。它们一方面通过改变DNA的结构,另一方面激活免疫系统,造成严重的免疫功能异常。其中,免疫复合物清除障碍在SLE的发病及自身免疫反应的维持中发挥重要作用,是SLE病理生理过程的重要环节。为此,探讨免疫复合物处理相关基因的变化对基因表达或细胞功能的影响,对深入认识SLE的发病机制有重要意义。 ITGAM和FcγRIIIA是两种与免疫复合物清除相关的免疫分子,其功能异常可导致免疫复合物处理障碍。ITGAM基因位于16p11.2,编码白细胞黏附分子β2整合素αMβ2(又称巨噬细胞分化抗原-1,补体受体3,CD11b/CD18)的α链。最近,国际上多个GWAS发现其功能单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点(R77H)rs1143679与SLE的遗传易感性显著相关。ITGAM主要表达于中性粒细胞和单核细胞,是一种主要的白细胞表面抗原家族,形成白细胞特异性整合素,活化后与细胞粘附分子ICAM-1,ICAM2,纤维蛋白原,C3bi,GPIbα等多种配体结合,调节白细胞的粘附、迁移,促进中性粒细胞之间及与内皮细胞间粘附,协助巨噬细胞、中性粒细胞、单核细胞发挥吞噬作用,参与免疫复合物的清除。FcγRIIIA基因位于SLE显著连锁区域1q23,编码免疫球蛋白受体家族(FcγR)成员FcγRIIIA,与Fc段IgG结合,结合的IgG亚型与SLE和狼疮肾炎关系密切。如FcγRIIIA-158V对IgG1、IgG3和IgG4单体或其调理的免疫复合物的亲和力比FcγRIIIA-158F高,此种差异影响着表达FcγRIIIA的各类细胞的功能效应。FcγRIIIA主要分布于巨噬细胞、天然杀伤(natural killer cell,NK)细胞表面。在免疫应答中,Fc受体与免疫复合物结合后,通过γ链的免疫受体酪氨酸活化基序向胞内传递活化信号,介导多种免疫反应如细胞活化,抗体依赖的细胞毒作用,产生超氧离子,抗原呈递,吞噬和吞饮等,在免疫复合物的清除、调节机体免疫功能方面发挥着重要作用。目前关于FcγRIIIA基因SNP位点(F158V)rs396991与SLE的遗传易感性研究较多,但结论并不一致,甚至相互矛盾。这些提示不同的遗传背景在疾病的病因学研究中常能提供有价值的信息。 综上所述,依据目前已知SLE发病机制的主要通路,免疫复合物清除异常是SLE发生发展的重要原因。ITGAM和FcγRIIIA都属于免疫复合物通路,作为两种与免疫复合物清除相关的重要免疫分子,其功能异常可导致免疫复合物处理障碍。因此,本研究检测了ITGAM和FcγRIIIA在SLE中的表达变化,以期探讨两者表达之间的内在联系,以及与临床特征、疾病活度的关系,这对于深入认识SLE的发病机制有重要意义,为疾病的早期预测和临床决策提供有力证据。 目的 (一)比较SLE患者和正常对照,SLE合并肾炎和未合并肾炎、活动期和稳定期SLE患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)ITGAM和FcγRIIIA mRNA水平及其蛋白表达差异,分析其与SLE疾病活动指数、临床及实验室特征的关联,并探讨二者表达水平之间的关联; (二)Meta分析ITGAM-R77H和FcγRIIIA-F158V基因多态性与SLE遗传易感性的关系,并分析其风险等位基因的剂量效应关系。 方法 病例组来自安徽医科大学第一附属医院和附属省立医院的SLE患者60例(均符合美国风湿病学会1997年修订的SLE分类诊断标准,排除患有其他全身性疾病者)。按照年龄、性别进行匹配,对照组选取安徽医科大学第一附属医院和省立医院的健康体检人群及部分正常研究生志愿者共60例。参照系统性红斑狼疮疾病活动性指数(systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI)、SLE的诊断及分类标准量表自行设计调查表,收集患者的一般情况和临床资料,并进行SLEDAI评分。获得研究对象知情同意后,抽取外周静脉血。 采用流式细胞术FITC、PE、PE-Cy5三染色法检测SLE患者和正常对照组外周血ITGAM(中性粒细胞、单核细胞及T淋巴细胞)和FcγRIIIA(NK、单核细胞)的蛋白表达水平,并探讨其临床意义;采用实时荧光定量PCR (real-time quantitive polymerase chain reaction,QPCR)检测SLE患者和对照组PBMC中ITGAM及FcγRIIIA mRNA水平,并探讨其临床意义;计算机检索2009年1月以前Medline、Blackwell、Embase等数据库并配合手工查找ITGAM-R77H和FcγRIIIA-F158V基因多态性与SLE遗传易感性的关联研究的文献,由两位评价员分别对筛选的文献进行质量评价,纳入符合条件的研究进行Meta分析,并探讨其风险等位基因的剂量效应关系。 采用SPSS 10.01进行统计学分析。经正态分布拟合优度检验,对患者组和对照组ITGAM和FcγRIIIA的表达差异采用t检验或Mann-Whitney秩和检验。对SLE患者组ITGAM和FcγRIIIA的表达量与SLEDAI及临床实验室特征作pearson相关分析,分析SLE患者PBMC不同细胞ITGAM和FcγRIIIA蛋白表达和mRNA水平之间的相关性。 结果 (一)SLE患者PBMC中ITGAM蛋白及mRNA水平变化及其临床意义 1. SLE患者与正常对照、SLE合并肾炎和非肾炎、活动期和稳定期患者PBMC中ITGAM蛋白表达水平: 与正常对照组相比,SLE患者中性粒/单核/T细胞ITGAM蛋白表达均显著降低(29.47±12.07 vs. 48.77±17.81,P0.001;258.81±120.02 vs. 415.00±254.78,P=0.013;380.54±100.26 vs. 548.22±272.07,P=0.003);与SLE非肾炎组相比,SLE肾炎组中性粒细胞ITGAM蛋白表达显著降低(242.90±119.91 vs. 322.45±106.47,P=0.043);但SLE活动组与SLE稳定期组PBMC中ITGAM的蛋白表达差异无统计学意义(P0.05)。 2. SLE患者PBMC中ITGAM蛋白表达与SLEDAI的相关性: SLE患者中性粒/单核/T细胞ITGAM蛋白表达与SLEDAI均无显著性关联(P0.05)。其中SLEDAI与患者中性粒细胞/单核细胞ITGAM蛋白表达呈正相关,与T细胞的表达负相关,但差异均无统计学意义。 3. SLE患者PBMC中ITGAM蛋白表达与临床及实验室特征的关联: 伴发浆膜炎、神经系统损害的SLE患者单核细胞ITGAM蛋白表达显著升高(P值分别为0.049, 0.047)。伴发C3降低的SLE患者中性粒细胞ITGAM蛋白表达显著降低(P=0.033);伴发抗-RNP阳性、ESR增高的SLE患者单核细胞ITGAM蛋白水平显著升高(P值分别为0.049,0.003)。 4. SLE患者PBMC中ITGAM mRNA水平的变化: 与正常对照组相比,SLE患者组PBMC中ITGAM mRNA水平显著降低(P=0.007);SLE肾炎组与非肾炎组、活动期组与稳定期组PBMC中ITGAM mRNA水平间差异均无统计学意义(P0.05) 5. SLE患者PBMC中ITGAM mRNA水平与SLEDAI的相关性: SLE患者PBMC中ITGAM mRNA水平与SLEDAI呈显著正相关(r=0.272,P0.035)。 6. SLE患者PBMC中ITGAM mRNA水平与临床及实验室特征的关联: 伴发关节炎的SLE患者ITGAM mRNA水平显著升高(P=0.025)。未发现ITGAM mRNA水平与实验室特征有显著关联(P0.05)。 (二)SLE患者PBMC中FcγRIIIA蛋白及mRNA水平变化及其临床意义 1. SLE患者和正常对照之间,SLE合并肾炎和非肾炎,活动期组和稳定期组PBMC中FcγRIIIA蛋白表达水平: 与SLE非肾炎组相比,SLE肾炎组NK细胞FcγRIIIA蛋白表达显著升高(P=0.011);与SLE稳定期组相比,SLE活动组NK细胞FcγRIIIA蛋白表达显著升高(P=0.022);但与对照组相比,SLE患者NK及单核细胞FcγRIIIA蛋白表达无统计学差异(P值均0.05)。 2. SLE患者PBMC中FcγRIIIA蛋白表达与SLEDAI的相关性: SLE患者NK/单核细胞FcγRIIIA蛋白表达与SLEDAI呈负相关,但差异均无统计学意义(P0.05)。 3. SLE患者PBMC中FcγRIIIA蛋白表达与临床及实验室特征的关联: 伴发关节炎的SLE患者NK细胞FcγRIIIA蛋白水平显著降低(P=0.025),而伴发肌炎的SLE患者FcγRIIIA蛋白显著升高(P=0.043);伴发脱发、肾脏病变的SLE患者单核FcγRIIIA蛋白水平显著升高(P值分别为0.013, 0.017)。伴发C3降低、白细胞减少的SLE患者NK细胞FcγRIIIA蛋白水平显著升高(P值分别为0.007,0.008);伴发IgA升高的SLE患者单核细胞FcγRIIIA蛋白水平显著降低(P=0.043)。 4. SLE患者PBMC中FcγRIIIA mRNA水平变化 与正常对照组相比,SLE患者组PBMC中FcγRIIIA mRNA水平显著降低(P=0.001);与SLE非肾炎组相比,SLE肾炎组PBMC中FcγRIIIA mRNA水平显著降低(P=0.015);SLE活动期组与SLE稳定期组PBMC中FcγRIIIA mRNA水平间差异无统计学意义(P0.05)。 5. SLE患者PBMC中FcγRIIIA mRNA水平与SLEDAI的相关性FcγRIIIA mRNA水平与SLEDAI呈负相关,但无统计学意义(r=-0.246,P0.05)。 6. SLE患者PBMC中FcγRIIIA mRNA水平与临床及实验室特征的关系伴发抗-SSB阳性、抗-RNP阳性、C3降低、IgG升高的SLE患者PBMC中FcγRIIIA mRNA水平显著降低(P值分别为0.041,0.003,0.029,0.003);未发现FcγRIIIA mRNA水平与临床特征有显著关联(P0.05)。 7. SLE患者PBMC中ITGAM和FcγRIIIA不同细胞表达水平之间的相关性分析SLE患者中性粒细胞ITGAM蛋白表达与其在单核细胞的表达呈显著正相关(r=0.661,P0.001)。 单核细胞ITGAM蛋白表达与FcγRIIIA表达呈正相关,与NK细胞FcγRIIIA蛋白表达呈负相关,但均无统计学差异(r=0.099,r=-0.045,P 0.05);中性粒细胞ITGAM蛋白表达与NK/单核细胞FcγRIIIA蛋白表达均呈负相关,但无统计学差异(r=-0.052,r=-0.102,P值均0.05);T淋巴细胞ITGAM蛋白表达与NK、单核细胞FcγRIIIA蛋白表达呈负相关,但均无统计学差异(r=-0.089,r=-0.073,P值均0.05)。 8. SLE患者PBMC中ITGAM和FcγRIIIA mRNA水平的相关性SLE患者FcγRIIIA mRNA与ITGAM mRNA水平呈负相关,但无统计学意义(r=-0.019,P0.05)。 (三)Meta分析:FcγRIIIA-F158V和ITGAM-R77H与SLE遗传易感性的关系 1. FcγRIIIA-F158V与SLE遗传易感性的Meta分析:最终有17个研究纳入FcγRIIIA与SLE的Meta分析,包括3,493个SLE病人和2,426个对照,病人中1711个SLE肾炎和1782个SLE非肾炎,其中1855个欧洲裔,409个非洲裔,1229个亚洲裔。Meta分析分为三组比较:SLE vs.对照,SLE肾炎vs.SLE非肾炎,SLE非肾炎vs.对照。结果发现:在总人群中,158F等位基因与SLE的遗传易感性显著相关[OR1.27,95% confidence interval (CI) 1.13–1.43] ,并且纯合子FF基因型在SLE组呈现剂量效应关系。按种族分层发现,158F等位基因与欧洲和亚洲裔SLE显著相关(OR1.30,95%CI 1.07–1.58;OR1.24 , 95%CI 1.04–1.48),且纯合子FF基因型仅在亚洲人群SLE中呈现剂量效应关系;158F等位基因仅与亚洲人SLE合并肾炎组显著相关(OR1.26, 95%CI 1.06–1.50);纯合子FF基因型与亚洲裔、欧洲裔SLE较非洲裔SLE关联强(OR1.61,95%CI 1.03–2.53;OR1.70,95%CI 1.12–2.58)。 2. ITGAM-R77H与SLE遗传易感性的Meta分析:共纳入了5个GWAS研究,包括12123个病人和17106个对照,Meta分析结果发现:风险等位基因A与SLE的遗传易感性显著相关(OR1.795 ,95%CI1.676-1.921),纯合子AA vs GG (OR3.540 , 95%CI 2.771-4.522)。 结论 (1)SLE患者PBMC中ITGAM mRNA及其蛋白表达均显著降低,且mRNA水平与SLEDAI呈显著正相关;SLE患者PBMC中FcγRIIIA蛋白水平无异常表达,但发现mRNA水平显著降低。SLE肾炎组FcγRIIIA蛋白显著升高但mRNA水平显著降低。不同临床特征及疾病活动度SLE患者ITGAM和FcγRIIIA表达有差异。 (2)SLE患者中性粒与单核细胞ITGAM的表达呈显著正相关。患者FcγRIIIA与ITGAM mRNA水平及蛋白表达均呈负相关趋势,但无统计学意义。尚不能确定FcγRIIIA与ITGAM在SLE发病中有相加作用,还需进一步蛋白质组学研究。 (3)ITGAM-R77H和FcγRIIIA-F158V与SLE的遗传易感性密切相关,且FcγRIIIA-158F呈剂量效应关系,158F等位基因与亚洲人狼疮肾炎显著相关。总之,我们从基因的功能表达和基因多态性方面证实了FcγRIIIA和ITGAM与汉族人SLE发病有关,作为免疫复合物处理途径重要分子FcγRIIIA和ITGAM可能在SLE的发病机制中起着重要作用,这将为阐明FcγRIIIA和ITGAM在SLE发病机制中的具体作用机制,为SLE的治疗和预后提供科学依据。


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