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SD大鼠脊髓损伤前后外周血和损伤局部T淋巴细胞亚群的变化

骆二红  
【摘要】:研究背景:传统的观点认为中枢神经系统损伤后的自身免疫反应会加重继发性损害不利于神神经再生。近年来,以色列研究小组提出“保护性自身免疫”学说,即中枢神经系统损伤后的自身免疫反应同时具有神经保护和促进神经再生的积极作用。我们认为导致学术界争论不休的原因:脊髓损伤后外周血和损伤局部的T淋巴细胞可能存在不同的功能亚群,有的亚群具有神经保护性潜能,而另外的则可能具有神经损害潜能,脊髓损伤后功能恢复的最终结果可能要决定于这些不同细胞亚群之间的平衡。 目的:观测SD大鼠脊髓损伤前及损伤后不同时间外周血及损伤局部T淋巴细胞亚群的变化。 方法:1.用纽约大学脊髓撞击仪,SD大鼠制备中等程度撞击损伤的脊髓损伤动物模型并评估其效果。 2.用流式细胞仪、CD3-FITC、CD8-PE、CD4-PE、CD25-PERCP、FOXP3-APC检测SCI前后外周血CD3~+、CD4~+T、CD8~+T细胞亚群和Treg细胞亚群。 3.用密度梯度离心方法分离新鲜脊髓局部浸润的淋巴细胞,用流式细胞术检测SCI前后CD3CD8阳性、CD3CD4阳性和Treg细胞亚群。 4.采用CD4和FoxP3双色免疫荧光标记抗体,检测SCI前后局部浸润的CD4阳性细胞和Treg细胞。 结果:1.用纽约大学脊髓撞击仪10g*25mm撞击SD大鼠的T9脊髓致SD大鼠双下肢肌力活动丧失,造成截瘫。病理观察差异显著,中等程度撞击损伤的脊髓损伤动物模型成功制备。 2.SCI前后不同时间点SD大鼠外周血淋巴细胞中CD3~+CD8~+细胞的比例,CD3~+CD4~+细胞中Treg细胞的比例无明显化(p0.05)。SCI后1、3、5天,1周的CD3~+T细胞,CD3~+CD4~+T细胞比例,以及CD3~+CD4~+/CD3~+CD8~+比值明显低于SCI前差异显著(p 0.05)。在SCI后2周,上述各T细胞亚群的比例均恢复到术前水平,两时间点之间比较无差异(p0.05)。 3.流式细胞术检测正常SD大鼠脊髓局部检测不出CD3阳性T细胞,损伤后检测到浸润的CD3阳性细胞,其中局部CD4阳性T细胞术后第3天分别与术后第1、3周之间差异显著(p0.05),脊髓损伤局部CD4阳性T细胞术后第1周与术后第3周之间差异显著(p0.05),CD8阳性T细胞的比例在术后第3天分别与术后第1、3周之间差异显著(p0.05),Treg的比例在术后第2周较高分别与第3天、第1周、第3周之间差异显著(P0.05)。 4.采用组织免疫荧光染色技术检测正常SD大鼠脊髓检测未发现CD4~+,Treg细胞,局部CD4~+细胞数量除了SCI术后1周与术后第2周、第3周之间比较无差异(p0.05),余各个时间点两两之间差异显著(p0.05),局部Treg细胞数量除了SCI术后1周与术后3周之间比较无差异外(p0.05),余各个时间点两两之间差异显著(p0.05),局部Treg/CD4~+比值SCI后第1天和2周两个高峰之间无差异p0.05,SCI后3天,1周,3周之间无差异(p0.05),余各个时间点两两之间差异显著(p0.05)。 结论:1.用纽约大学脊髓撞击仪制备SD大鼠的中等程度撞击损伤的脊髓损伤动物模型是较理想可靠的方法。 2. SD大鼠SCI手术后外周血中主要是CD3淋巴细胞、CD3~+CD4~+淋巴细胞的比例及CD3~+CD4~+/CD3~+CD8~+比值下降。SD大鼠SCI手术后外周血中CD3~+CD8~+淋巴细胞的比例及Treg/CD3~+CD4~+淋巴细胞的比例无明显变化。 3.流式细胞术检测正常SD大鼠脊髓检测不出活化的T细胞,与损伤后出现T淋巴细胞相比差异显著。相对外周血而言,损伤局部浸润的T细胞主要CD3~+CD4~+细胞为主,比例上升,CD3~+CD8~+细胞比例下降,Treg细胞/CD3~+CD4~+细胞比例下降。 4.采用组织免疫荧光染色技术分析正常SD大鼠脊髓未检测到CD4~+及Treg细胞,损伤后CD4~+、Treg细胞、Treg/CD4~+上升明显,差异显著。CD4~+、Treg数目伤后持续上升到第2周达高峰后开始下降,Treg/CD4~+比例在损伤后第1天及第2周出现两个高峰。


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