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microRNA-585-5p在胃癌恶性生物学行为中的作用与分子机制研究

贺艳  
【摘要】:【目的】胃癌是消化道肿瘤中恶性程度、发病率和死亡率均较高的肿瘤。微小核糖核酸(miRNA)几乎参与胃癌发生发展的全部过程,如细胞的增殖、凋亡、上皮间质转化、血管形成、侵袭和转移等。目前报道显示,miR-585-5p在肺癌、口腔癌以及心血管疾病中都有不同程度的异常表达,且在口腔癌中与miR-218一起,共同发挥着抑癌作用。但是在胃癌中miR-585-5p所发挥的作用一直未有报道。本课题旨在观察miR-585-5p对胃癌恶性生物学行为的影响,分析miR-585-5p在胃癌恶性表型与临床患者预后中的作用,并进一步探索其发生发展的机制,为胃癌患者的治疗提供新靶点。【方法】1.利用实时定量PCR方法检测胃上皮细胞和胃癌细胞中miR-585-5p的表达差异;胃癌组织芯片中,运用原位杂交(ISH)检测miR-585-5p的表达,并分析miR-585-5p与胃癌患者预后的关系。2.构建miR-585-5p的模拟物、抑制物以及过表达和干扰载体,并通过采用瞬时转染和稳定感染的方法,得到miR-585-5p功能获得与缺失细胞系。上调和下调miR-585-5p后,通过MTT、Transwell迁移和裸鼠转移瘤等实验探究其对胃癌增殖以及转移等的作用。3.生物信息学和实时定量PCR方法筛选出差异表达的候选靶基因;候选靶基因和miR-585-5p间的关系通过双荧光素酶报告基因检验;蛋白印迹(Western blot)和实时定量PCR检验靶基因在上调和下调miR-585-5p后的表达变化;功能实验和功能回复实验分别验证靶基因在胃癌中的功能和miR-585-5p调节靶基因对胃癌的影响。【结果】1.在胃癌细胞m RNA水平中,miR-585-5p表达明显降低;胃癌组织芯片中,miR-585-5p的表达低于其癌旁组织;预后统计分析显示,miR-585-5p与预后呈正相关。2.MTT增殖实验和Transwell迁移及裸鼠转移瘤实验分别表明,miR-585-5p与胃癌细胞增殖无关,具有抑制胃癌细胞迁移的作用。3.生物信息学和实时定量PCR共同筛选出明显差异表达靶基因MITF;双荧光素酶报告基因显示,miR-585-5p和MITF间存在一个直接调控点;功能实验和功能回复实验表明,MITF具有促进胃癌细胞迁移的作用,在m RNA和蛋白水平都与miR-585-5p呈负相关;突变MITF与miR-585-5p的结合位点,可以逆转miR-585-5p对MITF的迁移抑制作用;胃癌细胞免疫荧光实验中,MITF主要表达于胞质中,部分核表达;基于免疫组化的预后分析显示,胃癌患者预后和MITF呈负相关性。【结论】在胃癌细胞和组织中发现miR-585-5p的表达,miR-585-5p具有抑制胃癌细胞迁移的作用,且与增殖无明显相关性。高表达miR-585-5p的患者预后较低表达miR-585-5p的好。明确了miR-585-5p直接调节MITF抑制胃癌迁移的机制。MITF高表达患者相对MITF低表达患者的预后差。


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