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基于胰腺癌血清外泌体miRNA及CT表现对照研究

王成  
【摘要】:第一部分胰腺癌血清外泌体中miRNA标记物的筛选及验证目的:通过Illumina二代测序,筛选出胰腺癌血清外泌体中miRNA作为胰腺癌诊断生物标记物,扩大样本量对于筛选出的差异miRNA进行验证。材料与方法:(1)病例选择:根据纳入及排除标准,采集2017年6月至2019年1月期间,江苏省中医院、南京市鼓楼医院及解放军东部战区总医院共计56例患者,包括胰腺癌患者28例,良性病变患者23例,正常对照组5例。其中,10例胰腺癌患者,5例胰腺良性病变患者,5例正常对照组共计20例,分成两组用于Illumina二代测序;18例胰腺癌患者,18例胰腺良性病变患者用于验证筛选出的潜在生物标记物。(2)外泌体提取及鉴定:使用德国Qiagen公司生产的exo Easy Maxi Kit试剂盒提取外泌体,并使用透射电镜、纳米颗粒追踪分析以及Western blot实验,对提取外泌体进行鉴定;(3)外泌体中Total RNA提取:使用来自德国Qiagen公司的miRNeasy Serum/Plasma Kit从血清外泌体中提取RNA;(4)对提取后的Total RNA质检:使用美国Agilent公司生产的Agilent RNA 6000Nano Reagents PartⅠ试剂盒对得到的Total RNA进行质检;(5)对RNA进行测序:使用Illumina公司的Hiseq Xten对通过质检的文库进行深度测序;(6)筛选micRNA作为生物标记物:对测序得到的数据进行分析,根据miRBase数据库,使用GO及KEGG富集分析等筛选出miRNA作为潜在生物标记物;(7)生物标记物验证:使用RT-PCR技术对筛选出的潜在miRNA进行验证,对于两者之间的差异,差异倍数大于1.5,即认为有意义。结果:将20例样本分两组进行测序,第一组为胰腺癌组与正常对照组(5 vs 5),第二组为胰腺癌与胰腺良性病变组(5 vs 5);两组测序数据中,共有11个miRNA表达趋势相同,其中6个表达上调(hsa-miR-203b-5p,hsa-miR-342-5p,hsa-miR-337-5p,hsa-miR-149-5p,hsa-miR-877-5p,hsa-miR-203a-3p),5个表达下调(hsa-miR-1226-3p,hsa-miR-3182,hsa-miR-625-3p,hsa-miR-624-5p,hsa-miR-664a-5p);通过对比miRBase数据库及靶基因GO分析及KEGG通路分析最终挑选在胰腺癌血清外泌体中表达下调的hsa-miR-1226-3p作为胰腺癌潜在诊断标记物进行下一步验证对于潜在诊断生物标记物hsa-miR-1226-3p,使用RT-PCR技术对于扩大样本患者血清进行验证,发现hsa-miR-1226-3p在胰腺癌患者中表达下调,相对于胰腺良性病变患者血清中含量下调倍数为3.1,差异具有临床意义。结论:胰腺癌患者血清外泌体hsa-miR-1226-3p的含量与胰腺良性病变患者、正常对照组之间存在差异,且差异具有临床意义。血清外泌体中的hsa-miR-1226-3p可以作为胰腺癌诊断的特异性生物标记物。第二部分胰腺癌血清外泌体中miRNA-1226与CT表现对照研究目的:将胰腺癌血清外泌体中micRNA-1226的表达量与CT表现对照分析,探讨其与影像学特征之间的关系。材料与方法:病例选择:选择第一部分验证使用的18例胰腺癌患者影像资料;分析患者年龄、性别、病灶大小、部位、形态、边界、密度、各期增强扫描的CT值及特殊征象(如钙化、胰胆管扩张等)的显示及邻近组织受侵或远处转移等影像学征象;并与胰腺癌血清外泌体中miRNA-1226的表达量进行对比分析;统计软件采用SPSS16.0进行数据分析,计量资料间比较使用Mann-Whitney U检验及单因素ANOVA分析,使用Spearman相关分析计算计量资料与计数资料相关性;使用Pearson相关分析对两组计量资料进行相关分析。结果:将18例患者分为有侵犯或转移及无侵犯转移两组时,出现侵犯或转移组血清外泌体中miRNA-1226的2-??Ct值小于无侵犯转移组(P=0.018);使用Spearman进行相关分析发现,外泌体中miRNA-1226的2-??Ct值与侵犯转移存在相关性,外泌体中miRNA-1226的2-??Ct值越少,出现侵犯或转移的可能就越大。将血清外泌体中miRNA-1226的表达量与肿瘤的大小、各期CT值及胰管扩张等征象进行对照分析发现,两者无明显相关;当cut off值为1.0122,诊断出现侵犯或转移的敏感性和特异性分别为81.8%,85.2%,ROC曲线下面积为0.805。结论:胰腺癌患者血清外泌体中miRNA-1226的相对表达量与胰腺癌患者出现局部侵犯或转移之间存在相关性,当表达量较低时,出现局部侵犯或转移的可能性越大。


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