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尼达尼布对肺泡上皮细胞间质转分化的作用及机制研究

蒋莉莉  
【摘要】:目的:探讨尼达尼布是否通过影响VEGF/TGF-β1/Notch1信号通路抑制肺泡上皮细胞间质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),进而抑制肺纤维化(pulmonary fibrosis,PF)的发生与发展,从而为PF的治疗提供了理论依据。方法:雄性SD大鼠52只,随机分为对照组、博来霉素(Bleomycin,BLM)组、BLM+尼达尼布(50 mg/kg)剂量组、BLM+尼达尼布(100 mg/kg)剂量组,每组12只。采用气管内注射博来霉素(5000 U/kg)来建立大鼠的肺纤维化模型。造模后连续灌胃给药四周,对照组和模型组在相同环境下给予相等体积(1mL/100g)生理盐水。HE和Masson染色分别观察肺组织病理变化及胶原沉积情况。免疫组织化学法检测肺组织转化生成因子-β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I型胶原(collagen I)蛋白的阳性表达情况。大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(RLE-6TN)随机分为5组:Control组、血管内皮生成因子(VEGF,10ng/mL)组、VEGF+尼达尼布(1、10、100 nmol/L)剂量组。细胞用VEGF预处理1 h,再加入不同剂量的尼达尼布处理48h。Real time-PCR检测肺组织及(或)细胞collagen I、III型胶原(collagen III)、α-SMA、波形蛋白(Vimentin)、E-钙粘蛋白(E-Cadherin)、紧密结合蛋白(ZO-1)、VEGF、TGF-β1、Notch1 mRNA的表达情况。Western blot分析肺组织及(或)细胞中collagen I、collagen III、Vimentin、α-SMA、ZO-1、E-Cadherin、VEGF、TGF-β1、Notch1蛋白表达情况。结果:1.动物实验(1)HE染色结果显示正常组的肺组织肺泡结构无明显破坏,无明显炎症反应。与正常组相比,BLM组的大鼠肺泡结构破坏严重,炎性细胞浸润,肺组织发生实质性病变,肺泡间隔变宽,成纤维细胞显著增生。与模型组相比,尼达尼布各组给药四周后上述病理变化明显减轻。(2)Masson染色结果显示正常组的肺组织肺泡结构无明显改变,肺间质仅有少量胶原表达。与正常组相比,BLM组肺泡间隔明显增厚,肺间质胶原沉积明显增多,而不同剂量尼达尼布连续给药28天后肺组织胶原沉积明显减轻。免疫组化、real-time PCR及Western blot检测发现,与对照组相比,模型组的大鼠的肺组织中collagen I、III mRNA及蛋白表达明显上调(P0.01);与BLM组相比,尼达尼布各剂量组的肺组织collagen I、collagen III mRNA及蛋白表达明显降低(P0.05或P0.01)。(3)免疫组化、real-time PCR及Western blot检测发现,与对照组相比,模型组大鼠肺组织中Vimentin、α-SMA mRNA及蛋白的表达明显上调(P0.01)而E-cadherin及ZO-1mRNA及蛋白的表达明显降低(P0.01);与BLM组相比,尼达尼布各剂量组的肺组织α-SMA、Vimentin mRNA及蛋白的表达明显降低(P0.05或P0.01)而E-cadherin及ZO-1 mRNA及蛋白的表达明显升高(P0.05或P0.01)。(4)免疫组化、real-time PCR及Western blot分析发现,与对照组相比,模型组大鼠肺组织中VEGF、TGF-β1、Notch1 mRNA及蛋白表达明显上调(P0.01);与BLM组相比,不同剂量尼达尼布能明显下调肺组织VEGF、TGF-β1、Notch1mRNA及蛋白表达(P0.05或P0.01)。2.细胞实验(1)Real-time PCR和Western blot结果显示,与Control组相比,VEGF组TGF-β1、Notch1 mRNA及蛋白表达水平明显升高(P0.01);与VEGF组相比,不同剂量尼达尼布组TGF-β1、Notch1 mRNA及蛋白的表达明显降低(P0.05或P0.01)。(2)与Control组相比,VEGF组中Vimentin、α-SMA mRNA和蛋白均出现不同水平的上调(P0.01)。而ZO-1和E-Cadherin的mRNA和蛋白均出现了不同水平的下降(P0.01)。与VEGF组相比,不同剂量尼达尼布组Vimentin,α-SMA的mRNA和蛋白表达均不同程度的下调,而ZO-1和E-Cadherin的mRNA和蛋白表达均不同水平的上升(P0.05或P0.01)。(3)与正常组相比,VEGF组collagen I、collagen III mRNA和蛋白表达明显上调(P0.01);与VEGF组相比,不同剂量尼达尼布组collagen I、collagen III mRNA和蛋白的表达明显下调(P0.05或P0.01)。结论:尼达尼布对博来霉素诱导的肺纤维化大鼠肺泡上皮细胞转分化(EMT)具有明显的抑制作用,其机制可能与其抑制VEGF/TGF-β1/Notch1信号通路有关。


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