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“Cocktail”探针药物法评价人工牛黄对大鼠肝微粒体细胞色素P450不同亚型酶体内外代谢活性的影响

周文莉  
【摘要】:目的:人工牛黄作为牛黄(Bovis Calculus)的代用品,具有化痰定惊和清热解毒的效果,在临床上广泛用于治疗心血管系统、呼吸系统和中枢神经系统疾病,目前已和很多药物组成了中成药制剂。在人工牛黄被广泛使用的同时,由于中西药配伍使用所引发的严重不良反应逐渐受到重视,其中尤以中西药复方制剂感冒通(人工牛黄、双氯芬酸钠和扑尔敏组成的中西药复方制剂)引发血尿的症状最为突出,患者在使用该药一段时间后出现以血尿为主的近千例不良反应的报道。通过进一步的研究发现,发生相互作用的机制主要是由细胞色素P450酶介导的代谢性相互作用。本课题采用LC-MS/MS测定方法和探针药物法,研究人工牛黄对CYP450酶(Cyp2e1、Cyp3a1、Cyp2d1、Cyp2c11、Cyp2c6、Cyp2c7、Cyp2b1和Cyp1a2)体内外代谢活性的影响,以期为人工牛黄与其他西药或中药联合应用提供参考。方法:体外试验:采用大鼠肝微粒体外孵育法建立测定CYP450酶特异性底物对应的代谢产物N-去乙基阿莫地喹(Cyp2c7)、对乙酰氨基酚(Cyp1a2)、右啡烷(Cyp2d1)、1-羟基咪达唑仑(Cyp3a1)、羟化安非他酮(Cyp2b1)、4-羟基美芬妥英(Cyp2c11)、6-羟基氯唑沙宗(Cyp2e1)和4-羟基甲苯磺丁脲(Cyp2c6)的LC-MS/MS定量分析方法,并对该法进行方法学验证。建立以非那西丁/安非他酮/阿莫地喹/氯唑沙宗/甲苯磺丁脲/美芬妥英/右美沙芬/咪达唑仑作为CYP450酶(Cyp1a2/Cyp2b1/Cyp2c7/Cyp2e1/Cyp2c6/Cyp2c11/Cyp2d1/Cyp3a1)特异性底物的体外评价体系用于研究对大鼠肝微粒体CYP450酶抑制作用,CYP450酶的活性用对应的代谢产物的浓度来表征,并通过对八个阳性抑制剂(α-萘黄酮/噻替哌/槲皮素/奎尼丁/磺胺苯吡唑/噻氯匹定/酮康唑/4-甲基吡唑)的CYP450酶抑制潜能的考察,验证该体系的可靠性。考察人工牛黄提取液对CYP450酶亚型的影响,以孵育体系中加入人工牛黄与未加人工牛黄的对照组进行比较,测定代谢产物,分析人工牛黄对酶亚型的影响。体内试验:建立同时测定大鼠体内CYP450酶特异性底物对应的代谢产物的LC-MS/MS分析方法,并对该法进行方法学验证。将12只SD雄性大鼠随机平均分为2组:人工牛黄组(10mg/kg)和对照组,连续灌胃14天,第15天各组大鼠分别尾静脉注射探针药物,于预设时间点眼眦取血,用建立的分析方法测定大鼠血浆中八种代谢产物的血药浓度,用DAS2.0软件计算代谢产物的主要药代动力学参数,通过对比人工牛黄组和空白组的主要药动学参数,评价人工牛黄在大鼠体内对细胞色素P450不同亚型酶Cyp2e1、Cyp3a1、Cyp2d1、Cyp2c11、Cyp2c6、Cyp2c7、Cyp2b1和Cyp1a2酶代谢活性的影响。结果:体外试验:建立了检测周期短,灵敏度高,操作简便的可以同时测定体外肝微粒体中八种探针底物代谢产物的LC-MS/MS方法。测得IC_(50)和FDA参考值相近,表明体外孵育的评价体系中八种阳性抑制剂对各自的CYP450酶均有显著抑制作用。结果显示,人工牛黄对Cyp3a1、Cyp2d1、Cyp2c11、Cyp2c6四种酶亚型均有不同程度的抑制作用,对Cyp2e1、Cyp2c7、Cyp2b1和Cyp1a2酶活性无明显影响。体内试验:建立了一种LC-MS/MS分析方法,可以同时测定八种探针药物代谢产物对乙酰氨基酚、N-去乙基阿莫地喹、右啡烷、1-羟基咪达唑仑、羟化安非他酮、4-羟基美芬妥英、4-羟基甲苯磺丁脲和6-羟基氯唑沙宗在大鼠体内的血药浓度。专属性、线性关系良好,准确度、精密度高,稳定性及基质效应均符合生物样本检测要求。与对照组相比,实验组对乙酰氨基酚、N-去乙基阿莫地喹、右啡烷、1-羟基咪达唑仑、羟化安非他酮、4-羟基甲苯磺丁脲和6-羟基氯唑沙宗的主要药动学参数AUC_((0~t))、AUC_((0~∞))、MRT_((0-t))、MRT_((0~∞))、Vd、CL和t_(1/2)都没有无显著性差异。人工牛黄提取物对4-羟基美芬妥英的药动学参数产生了明显的影响,AUC(0~t)明显的增加,Vd明显降低。结论:人工牛黄体外对Cyp3a1、Cyp2d1、Cyp2c11、Cyp2c6四种酶亚型均有不同程度的抑制作用,对Cyp2e1、Cyp2c7、Cyp2b1和Cyp1a2活性无明显影响。人工牛黄在体内对Cyp2c11有诱导作用,对Cyp2e1、Cyp3a1、Cyp2d1、Cyp2c6、Cyp2c7、Cyp2b1和Cyp1a2酶活性无影响。


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