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扬子鳄肠道寄生虫多样性分析及新种线虫Ortleppascaris sinensis的生物学研究

赵金红  
【摘要】:扬子鳄是我国特有的珍稀物种,其体内寄生虫的研究资料匮乏。本研究首先对扬子鳄粪样进行调查,初步探究扬子鳄肠道内寄生虫的多样性;然后采用扫描电镜和分子生物学方法对扬子鳄肠道内优势线虫成虫Ortleppascaris sinensis进行鉴定,通过线粒体基因组全序列探讨它的分类地位;进一步分析该优势线虫对扬子鳄胃肠道的损害情况,探索快速分子诊断方法,最终为扬子鳄饲养繁殖时,实现对该寄生虫的检测和监测,保护扬子鳄珍稀物种。主要研究内容如下。1.饲养扬子鳄肠道寄生虫多样性分析收集安徽扬子鳄国家级自然保护区管理局的扬子鳄粪样,采用生理盐水直接涂片法、碘液染色法、饱和盐水浮聚法和自然沉淀法进行检查。结果共收集粪样328份,发现有虫卵和包囊,经鉴定原虫2科3属(阿米巴属、艾美球虫属和等孢球虫),线虫4科5属(蛔属、Ortleppascaris spp.、毛细线虫属、弓首属和圆线虫属),吸虫3科1属(棘口属、裂体科和隐殖科),其中隐殖科有卵2类。大多数饲养的扬子鳄至少感染一种寄生虫。此外,物种数、物种丰富度指数、多样性指数、均匀度指数在夏季7、8月和青壮年鳄较高。2.线虫Ortleppascaris sinensis的形态和分子生物学特征对扬子鳄肠道内获得的优势线虫进行形态学和分子生物学鉴定。形态学上进行了活体、光学显微镜和扫描电镜观察,分子生物学上扩增该线虫的ITS、18S和COI分子标记。结果发现,该线虫形态学上,头部、食管、胃和肠、尾、排泄系统、交合刺、尾乳突、引带、阴门位置、侧翼、虫卵等特征均符合Ortleppascaris属线虫,但又不完全同于已发现的Ortleppascaris属线虫。与NCBI BLAST比对,发现与仅记录的物种Ortleppascaris sp.的ITS、18S和COI序列的最大相似性(覆盖率、最大一致性)分别为239(18%,93%),750(47%,98%)和682(100%,86%)。本研究的线虫与已发现的Ortleppascaris属线虫来源于不同宿主、不同地区,根据形态学和分子生物学特征,认为O.sinensis是一个新的生物学种类。该线虫的命名是根据宿主扬子鳄种名(Alligator sinensis)而得来。Ortleppascaris属物种在我国是首次记录,也是扬子鳄体内感染的首次报道。3.线虫Ortleppascaris sinensis的线粒体基因组测定及蛔目系统发生分析通过线粒体基因组测定及蛔目系统进化树分析进一步探讨线虫O.sinensis的系统位置。结果显示,线虫O.sinensis线粒体基因组为典型的闭合双链DNA分子,长度为13 828 bp,含12个蛋白质编码基因、22个t RNA基因、2个r RNA基因和1个最大的非编码区(AT富含区),全部由一条编码链编码,且沿相同方向进行转录,排列方式与蛔目其他大部分线虫相同;22个t RNA基因长度在55~63 bp之间,其二级结均无法折叠形成后生动物典型的三叶草结构,均为缺乏T-臂或D-臂的非典型结构;rrn S位于trn E基因和trn S2 UCN基因之间,rrn L位于trn H基因和nad3基因之间;AT富含区位于trn S(UCN)基因和trn N基因之间,长度为452 bp,起始端有多聚T和多聚A片段,二级结构显示能形成多个稳定的茎环结构;根据Gen Bank上已公布的蛔目线虫线粒体全序列,进行BI、MP、ML系统进化树分析,发现线虫O.sinensis独立成单一分类群,更加支持属于异唇科的结论。4.线虫Ortleppascaris sinensis对扬子鳄胃肠壁的损害线虫O.sinensis是扬子鳄胃肠道内的优势线虫,进一步分析该线虫对扬子鳄胃肠壁的损害情况。结果发现,肉眼可见胃肠壁组织黏膜尚光滑,皱襞较规则,见多灶针尖大小凹陷区。HE染色切片镜检发现,病变仅累及粘膜层和粘膜下层,而未达肌层。病灶处见多灶浅表糜烂或粘膜凹陷区,糜烂面覆有炎性渗出、坏死物,粘膜缺损区粘膜变薄、凹陷,但结构完整,符合粘膜损伤修复后改变。部分粘膜损伤区域下可见肉芽组织性炎症。5.线虫Ortleppascaris sinensis的LAMP快速检测为进一步快速诊断线虫O.sinensis,本研究根据O.sinensis的靶序列18S建立了LAMP反应体系,检测到成虫基因组DNA的敏感性为2.75pg/μL,与人蛔虫、美洲钩虫、肝片形吸虫、日本血吸虫均未出现交叉反应,并从感染该线虫的扬子鳄粪样中扩增到特异性产物。本方法仅需一个水浴锅,利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶,在64℃条件下,保温1h,即可完成核酸扩增反应,通过加入核酸染料肉眼观察颜色变化即可判断结果,缩短了现场检测时间,有利于基层和现场的检测以及流行病学调查。


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