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基于酶联免疫斑点技术的水痘—带状疱疹病毒中和抗体检测方法的建立

陈丽宏  
【摘要】:水痘-带状疱疹病毒(Varicella Zoster Virus, VZV)是引起水痘和带状疱疹的病原体,具有严重的危害性。目前已有基于vOka株的水痘减毒活疫苗上市,在较好地预防水痘的同时,却增加了接种者带状疱疹的发生风险。由VZV引发的带状疱疹目前尚缺乏特效治疗药物。VZV中和抗体在阻断病毒体内扩散及感染中起到重要的作用,同时也有望成为带状疱疹的特异治疗药物。然而,目前对于VZV中和抗体的检测方法仍存在许多问题,难于同时满足快速、准确、高通量的需求。为此,本研究探索建立一种新型的基于酶联免疫斑点法的VZV中和抗体高通量检测方法。 本研究首先探索获得可高效检测感染细胞内病毒抗原的检测抗体。由于膜蛋白是暴露在VZV颗粒表面的包膜组成成分,存在亲和表位和中和表位,因此本研究将探索获得具有良好反应特异性和检测灵敏度的VZV糖蛋白单抗。通过对VZV保护液成分优化和冻融时间的摸索制备获得高滴度的无细胞VZV病毒。将无细胞病毒免疫小鼠后筛选获得6株可特异性结合Glycoprotein K(gK)抗原的单克隆抗体。对这6株单克隆抗体进行进一步的表位鉴定,确定其关键亲和表位处于gK的281-295位氨基酸。选择其中一株单抗18A10进行进一步鉴定,确定了其最短结合表位和关键氨基酸位点的分布。本研究进一步制备了辣根过氧化物酶标记的18A10(HRP-18A10)用于VZV感染细胞的酶联免疫斑点检测,对系统进行检测时间、感染滴度等优化,成功建立了较为稳定的VZV中和抗体酶联免疫斑点检测方法。与传统的空斑减少法平行比较,新型酶联免疫斑点检测法对鼠血清标本的检测特异性为100%,检测结果一致性为95.65%,显示了新方法具有良好的可靠性。VZV中和抗体酶联免疫斑点检测法的检测时间仅需2天,可在96孔板中利用自动化的仪器设备进行快速检测,避免了传统方法的主观误差,有利于进行快速高通量检测。 综上所述,本研究通过筛选获得了VZV-gK的特异性单克隆抗体,并应用于建立VZV中和抗体酶联免疫斑点检测法,相比于空斑减少法,存在省时、高通量检测的明显优势,并且能够保证血清样本的检测正确率,可为临床血清的检测和实验室中和表位研究提供更多支持。


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