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海洋环境中稀有放线菌的选择分离及新种鉴定

王霏  
【摘要】:放线菌在自然界分布极为广泛,且具有丰富的天然产物生物合成基因簇,如非糖体肽酶基因簇,聚酮合酶Ⅰ、Ⅱ基因簇等。由此能够产生结构类型丰富、生物活性多样的次级代谢产物,是抗生素、免疫抑制剂和酶抑制剂等的重要来源。目前已发现的数万种天然抗生素中约70%是由放线菌所产生的,其中链霉菌占主要地位。随着对链霉菌持续的开发利用,不断有重复的菌株以及重复的生物活性物质被分离得到。为了发掘新的生物活性物质,人们将目光转向了人类尚未完全开发的特殊资源环境(海洋环境);和具有产生新生物活性物质潜力的菌株(稀有放线菌)。海洋环境其本身复杂多变的性质,给予生活于其中的放线菌特殊生理生化特征和特殊的代谢途径,使其能够产生结构新颖的次级代谢产物。因此,海洋环境中的稀有放线菌是一类值得深入研究与开发的药用微生物资源。本文以深海沉积物、深海硫化物和滨海红树林植物根际土壤的14份海洋环境样品作为分离源,采用聚乳酸培养基(PLA)、甘油-天门冬酰胺培养基(ISP 5)、脯氨酸-MOPS培养基、淀粉酪蛋白培养基(SC)、R2A培养基和2216E培养基6种培养基进行稀有放线菌的选择性分离,总共分离到206株放线菌。根据其菌落形态特征和生物活性数据,对其中的109株放线菌进行16S rRNA分子测定。16SrRNA基因序列比对结果显示,在206株放线菌当中有106株为稀有放线菌,占所分离到的放线菌总数比例为51.5%,占所测菌株的97.2%,有极高的稀有放线菌出菌率。分离得到的放线菌可归为7个属,分别为拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)92株、野野村氏菌属(Nonomuraea株、诺卡氏菌属(Nocardia)4 株、微杆菌属(Microbbacterium)3 株、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia1 株、短杆菌属(Brevibacterium)1株、考克氏菌属(Kocuria)1株;只有3株为链霉菌属(Streptomyces)。对1株稀有放线菌XMU 110进行了菌落形态观察、生理生化特征描述、细胞化学组分分析以及分子鉴定等多相分类研究,从表型、基因型和系统发育三个层次进行系统分析,并最终确定其新种地位。XMU 110为野野村氏菌属的一个新的分类单元,命名为美丽异木棉野野村氏菌属(Nonomuraeaceibaesp.nov.)。本论文还使用固体和液体两种发酵方式对145株放线菌进行了小量发酵,并测定其290份发酵粗提物的抗菌和抗肿瘤活性。抗菌活性采用滤纸片法,分别以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、大肠杆菌、黑曲霉和白色假丝酵母作为指示菌。在所测菌株中有106株放线菌粗提物对一种或多种指示菌具有抑制作用,占供测菌株总数的73.1%。采用MTS法,以人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231、人骨肉瘤细胞U20S、人肝癌细胞HepG2、人食管癌细胞kyse-450、人早幼粒白血病细胞HL-60、人套细胞淋巴瘤细胞JEKO-1、人恶性黑色素瘤细胞A375、人胃腺癌细胞BGC823这9种肿瘤细胞系为指示细胞株。实验结果显示,有66株放线菌粗提物对一种或多种指示细胞株具有抑制作用,占供测菌株总数的45.5%。研究结果显示,海洋环境中稀有放线菌资源丰富,且菌株中有不少具有高抗菌和抗肿瘤活性,表明海洋放线菌是一类极具潜在开发价值的药用微生物资源。


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