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拟穴青蟹胚胎和幼体发育期分子免疫基础及幼体对病原感染的免疫应答

马笑晚  
【摘要】:1、本项研究所采用的青蟹样本是成熟青蟹卵巢,抱卵蟹上采集的各期青蟹胚胎样品,以及孵化后的幼体,包括胚胎阶段的各期(Eml胚胎期、Em2胚胎期、Em3胚胎期、Em4胚胎期和Em5胚胎期)、幼体各期(溞状Ⅰ期、搔状Ⅱ期、溞状Ⅲ期、溞状Ⅳ期、溞状Ⅴ期、大眼幼体和仔蟹Ⅰ期)。对溞状Ⅰ期、大眼幼体和仔蟹Ⅰ期进行了 LPS刺激和解藻弧菌感染的研究,并采集样品。2、本研究首先利用各胚胎发育期和溞状幼体Ⅰ期样本建立了 一个转录组库,然后在此转录组库的基础上,通过数字表达谱技术对青蟹发育早期差异表达基因进行了研究,共得到9.42 G数据量,其中拼接得到116,370条transcripts及77,643条unigenes。通过NR数据库注释16,170条基因(占全部注释基因的20.82%),PFAM数据库注释18,556条基因(占全部注释基因的23.89%),GO数据库注释19,164条基因(占全部注释基因的24.68%)。3、对各胚胎发育期和溞状幼体Ⅰ期样品进行蛋白质组测序,利用iTRAQ技术进行蛋白质相对定量,共得到谱图338,059张,通过Mascot软件进行分析后,匹配到的谱图数量是16,362张,其中Unique谱图数量为6,593张,共鉴定到642个蛋白,2,645个肽段。GO分类下与免疫相关基因注释量达到1.14%。4、揭示了幼体各发育阶段的转录组情况,对21个样本进行转录组测序,共得到142.94 G的数据量,其中拼接得到553,591条transcripts和418,297条unigenes。通过NR数据库注释85,908条基因(占全部注释基因的20.53%),PFAM数据库注释96,993条基因(占全部注释基因的23.18%),GO数据库注释98,091条基因(占全部注释基因的23.45%)。5、通过对转录组数据分析,揭示青蟹发育早期存在多个免疫相关的系统:胚胎发育阶段筛选到了多种免疫相关基因,共筛选出43个免疫相关基因的122个转录本,幼体阶段共筛选出56个免疫相关基因的267个转录本,包括模式识别受体(Dscam等)、抗菌肽(Scygonadin等)、调控抗菌肽产生的通路Toll信号通路(TLR等)和IMD通路(Relish等)、酚氧化酶原系统(proPO等)、补体系统(C1q等)和凝血系统(clottingfactorB等)的免疫因子;表明在拟穴青蟹的发育早期,就存在4个关键的体液免疫系统:酚氧化酶原系统、凝血系统、补体系统和抗菌肽,预示其在青蟹发育阶段具有重要的免疫作用。6、揭示了自然状态下胚胎和幼体期不同抗菌肽种类的生发规律:胚胎期发现存在crustin、ALF、arasin、carcinin、hyastatin、scygonadin 和 lysozyme 7个已知抗菌肽;幼体期发现存在 crustin、ALF、arasin、carcinin、lysozyme 和 hyastatin 6个已知抗菌肽;发现不同种类的抗菌肽具有生发规律性,胚胎早期只有scygonadin有较高表达,但在后期阶段不同抗菌肽如crustin、ALF和hyastatin均有较高表达,说明在发育过程的不同时期会产生不同种类的抗菌肽应对病原微生物的感染;同时发现随着发育过程抗菌肽转录本数量会增加,幼体期的抗菌肽种类相对胚胎期减少,但抗菌肽的转录本表达量较高,推测由于青蟹幼体期相对胚胎期缺少物理性保护,青蟹需要表达较高量的抗菌肽抵御外来病原的侵染。7、转录组数据分析揭示青蟹早期存在Toll信号通路和IMD通路:胚胎期Toll 信号通路含有 Spatzle、TLR、Pelle、TRAF6、Cactus 和 Dorsal 组件;幼体期包含 Spatzle、TLR、MyD88、Pelle、Tube、TRAF6、Cactus、Dorsal 和 Deaf 组件。1MD通路在胚胎期的组件有IMD、IAP、IKKε、IKKβ和Relish,在幼体期有IMD、IAP、IKKε、IKKβ、Dredd和Relish。通路中大部分重要组件表现一定的表达量,推测这些信号通路因子可能参与了抗菌肽及其它免疫因子的调控。在胚胎阶段,Toll和IMD通路的组件可以被检测到,但相较于果蝇的经典通路,缺少了多个重要的因子。幼体阶段这2个通路中筛选到的多个免疫相关因子相较于胚胎时期,与果蝇经典通路更为相似。8、揭示了青蟹早期发育中还存在酚氧化酶原系统及其相关因子:典型的酚氧化酶原系统因子也在胚胎和幼体发育阶段均被发现,并且在胚胎早期发育阶段表达量较高,酚氧化酶原系统中被发现的关键因子与胚胎期没有显著差别。发现胚胎和幼体期存在 proPO、ppaf、SPH、LGBP、ppae、pacifastin、serpin、serine proteinase、α2m、peroxinectin 和 QM 等基因;其中 LGBP、pacifastin 和 ppae 是首次在青蟹中发现,而且这些因子在胚胎发育早期就已有较高的表达量,说明proPO系统可能在青蟹早期发育阶段较其他免疫系统起到了重要作用,有趣的是很多关键因子可能通过母源传递,在胚胎期发挥作用。9、对3个不同期的108个幼体样品进行解藻弧菌感染实验,并进行数字表达谱测序,共得到654.33 G的clean data数据量。解藻弧菌处理后溞状幼体Ⅰ期差异表达的基因共8,356个;大眼幼体中差异表达的基因共4,665个;仔蟹Ⅰ期中差异表达的基因共14,195个。10、对3个不同期的108个幼体样品进行LPS刺激实验,并进行数字表达谱测序,共得到644.86 G的clean data数据量。LPS处理后溞状幼体Ⅰ期差异表达的基因共2,117个;大眼幼体中差异表达的基因共4,725个;仔蟹Ⅰ期中差异表达的基因共9,937个。11、通过对LPS刺激和解藻弧菌感染后样品的转录组数据进行比较,发现单一细菌成分LPS刺激和解藻弧菌感染引起的基因转录本表达谱有较大差异。LPS刺激下,溞状幼体Ⅰ期、大眼幼体期以及仔蟹Ⅰ期特异性差异表达的通路或基因相对较少,包括溞状幼体Ⅰ期proPO,大眼幼体期的TAK1、galecin和仔蟹Ⅰ期的pellino、ppae;而解藻弧菌感染下,溞状幼体Ⅰ期、大眼幼体期以及仔蟹Ⅰ期特异性差异表达的通路或基因则较多,包括溞状幼体Ⅰ期的ppaf、peroxinectin、MyD88、TRAF6、Dorsal 和 C-type lectin;大眼幼体期的 MyD88 和 Dorsal;仔蟹Ⅰ期的抗菌肽arasin、Toll信号通路的多个组件Spatzle、MyD88和IRAK4,EMD通路的TAK1,proPO系统的α2m和peroxinectin,模式识别受体Techylectin。LPS和解藻弧菌处理后也产生共同显著性差异表达的免疫相关基因,溞状幼体Ⅰ期的抗菌肽ALF和crustin,模式识别受体Dscam、SCR和TLR,proPO系统的pacifastin、α2m 和 serpin;大眼幼体期的抗菌肽 ALF、arasin 和 crustin、Toll 信号通路的 TLR 和 Spatzle、IMD 通路的 Relish、proPO 系统的 pacifastin、serpin、ppaf、ppae和α2m、模式识别受体Dscam、SCR和C-type lectin;仔蟹Ⅰ期的抗菌肽 ALF 和 crustin、Toll 信号通路的 TLR、Pelle、IRAK1 和 Dorsal、IMD 通路的 Relish、proPO 系统的 serpin 和 pacifastin、模式识别受体 SCR、C-type lectin、Dscam和mannose-binding protein。结果表明青蟹早期发育阶段具备了较强的免疫基础,针对不同的刺激或感染,机体会产生相应的免疫因子和免疫应答,从而发挥相应的免疫学功能。12、选择在胚胎和幼体都存在,以及LPS刺激和解藻弧菌感染下诱导表达的免疫相关因子SpLGBP进行了进一步研究。克隆获得了 SpLGBP的基因序列,其编码364个氨基酸,预测分子量为41.41 kDa,理论等电点为4.5。发现青蟹SpLGBP含有两个细胞黏附肽RGD(Arg-Gly-Asp)基元,两个潜在的N-糖基化位点NRS和NDS,一个激酶C的磷酸化位点SAR,从蛋白79位至262位氨基酸为糖苷水解酶家族16(Glycohydro 16)结构域。ELISA分析结果显示,SpLGBP蛋白可结合脂多糖、肽聚糖与脂磷壁酸。显微镜观察显示,SpLGBP蛋白可以使革兰氏阴性菌(弗氏志贺氏菌、施氏假单胞等)革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)和真菌(毕赤酵母GS115和白假丝酵母)凝集,并且该蛋白的凝集能力具有钙离子依赖性。综上,本论文首次揭示了自然状态下青蟹早期发育阶段的先天性免疫特点及其发生发展地规律。其中,抗菌肽的产生和表达具有规律性,但是可能没有母源传递的特性;青蟹早期阶段调控抗菌肽表达的Toll和IMD的信号通路,与果蝇和虾的通路存在着同源性;酚氧化酶原系统因子在早期发育阶段具有重要作用,并可能为母源特性因子;补体系统因子也可能存在着母源传递的特性;青蟹的凝血系统可能随着血淋巴系统的逐渐完善开始表达。另外,通过人工感染幼体脆弱期的幼体,揭示了青蟹先天性免疫相关因子在病原感染下的表达特性及发生发展地规律性。LPS刺激和解藻弧菌感染下免疫相关因子的表达存在着异同,针对不同的病原感染,机体产生相应的免疫因子和免疫应答,从而发挥相应的免疫学功能。通过获得的转录组及蛋白质组数据,为继续深入研究青蟹早期发育阶段的免疫特性提供了大量材料,并奠定了基础。


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