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利用多种策略整合的方式研究verucopeptin的药效单元及其抗肿瘤的分子机制

王跃宙  
【摘要】:天然产物一直在人类健康和新药研发中占据着重要的角色。然而在进入20世纪90年代后,天然产物来源的药物研发不可避免的进入了低谷。其中重复分离,产物微量以及微量产物重现性差极大的阻碍了天然产物在高通量筛选中的应用以及动物实验体内药效的评价。另外天然产物因为结构复杂,手性中心多,难以用探针标记等特点使得天然产物靶点鉴定及其困难,致使很多活性天然产物的作用机理依然不清楚。天然产物需要新的研究策略来走出困境。本论文以整合策略的方式研究了抗肿瘤活性物质verucopeptin的药效成分和作用的分子机理。首先,Verucopeptin属于含有哒嗪烷酸和六元吡喃的环酯肽家族,这个家族普遍有着出色的抗肿瘤抗菌活性,我们认为可能是其结构上共性导致,并将其命名为PA-PCD(piperazic acid containing pyranylated cyclodepsipeptide)家族。另外,通过CCLE(CancerCellLine Encyclopedia)1094株肿瘤细胞活性筛选,verucopeptin对超过了 66%的肿瘤细胞的半致死浓度(IC50)都小于100nM。同时,在多重耐药细胞SGC7901/VCR的测试中,和17个临床药物以及工具化合物的对比下,verucopeptin展示了最强的活性。基于verucopeptin优秀的化学骨架和独特的生物活性,我们对其开展了系统的研究。通过对verucopeptin的产生菌Actinomadurasp.XM-4-3进行全基因组测序和生物信息学分析,我们发现了 verucopeptin的生物合成基因簇,通过在线预测和遗传操作分析,我们提供了 verucopeptin完整的生物合成途径。另外,通过组成型表达基因簇中LuxR家族途径特异正调控基因Ver A显著提高了 verucopeptin的产量并用于后续研究。接下来,我们通过合成生物学结合有机化学的策略生成了 18个verucopeptin的衍生物,通过测试他们对HL60,A375和MDA-MB-231的细胞毒活性后,我们得到了这系列化合物完整的构效关系,并且发现哒嗪烷酸,六元吡喃环,环外双键以及三维的环状架构是决定verucopeptin活性的关键药效因素。由于verucopeptin的羟氨脱羟基产物VE-2几乎保持了和verucopeptin 一样的活性,这提示我们羟氨部位可以接生物探针来钓取verucopeptin的作用靶点。我们通过在verucopeptin羟氨部位连接末端炔基的光敏基团得到探针VE-P,并且利用原位点击化学和细胞器导向的表型分析发现verucopeptin作用于溶酶体,并且诱导溶酶体释放活性氧(ROS)最终导致细胞走向凋亡。另外,通过经典点击化学,生物素点击,以及LC-MS-MS分析,我们发现verucopeptin可能作用于V-ATPase(vacuolar H+ATPase),随后在 HL60 以及过转 HA-ATP6V1B2 和HA-ATP6V1D的293T细胞中,我们都发现了 VE-P和这两个亚基存在特异的结合,并且在体外酸化模型中,我们确定了 verucopeptin在10 nM的浓度下就可以完全抑制V-ATPase的功能甚至强于阳性化合物BafA1。同时,我们还验证了 VE是通过作用于V-ATPase来下调mTORC1信号通路。综上,本学位论文通过整合的化学生物学研究策略揭示了抗肿瘤化合物verucopeptin的分子机制,同时也揭示了 verucopeptin结构中的重要药效单元。该研究一方面阐述了 V-ATPase作为靶点在肿瘤治疗中的极大潜力,同时也展现了整合化学生物学策略对天然产物科学研究和药物研发的重要性。


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