深海太平洋火色杆菌粗琼胶降解代谢途径及寡糖的新型制备方法研究

【摘要】：琼胶寡糖是琼脂糖降解后产生的水溶性糖,与琼脂糖相比,琼胶寡糖在食品、医药及生物科技等领域具有更广阔的应用。本课题组自西太平洋深海沉积物中获得一株太平洋火色杆菌(Flammeovirga acifica WPAGA1),前期研究发现该菌能直接降解龙须菜中的粗琼胶产寡糖,并建立了“一步法”产寡糖的工艺。然而,由于龙须菜粗琼胶中的硫酸基团含量很高,目前研究的琼胶酶均无法以其做为底物,而且没有相关代谢机制的研究报道,因此阐明该菌对粗琼胶的代谢机制具有重要的意义。本文针对此开展研究,主要研究内容和取得的成果如下:(1)菌株WPAGA1能利用多种多糖为唯一碳源生长,包括琼胶、卡拉胶、阿拉伯半乳聚糖、淀粉、海藻酸、几丁质、纤维素、岩藻聚糖、紫菜聚糖及木聚糖,胞外酶活性研究表明,菌株WPAGA1能分泌与上述9种复杂多糖相应的多糖降解酶,其中对琼胶的活性最高,卡拉胶次之。琼胶降解实验发现菌株WPAGA1能利用琼胶为唯一碳源生长,并且能分泌至少6个琼胶酶。(2)为了从基因水平揭示菌株WPAGA1多糖降解能力,对该菌株进行了基因组测序,结果表明,菌株WPAGA1基因组大小约为6.6 M,G+C含量为32.89%,共有5036个编码基因,以及基因岛、ncRNA、CRISPR等丰富的基因组元件,利用KEGG、COG、GO及CAZy等数据库对菌株WPAGA1基因组数据进行功能预测,发现碳水化合物代谢相关的酶基因非常丰富,共预测到了 1022个与碳水化合物代谢相关的酶基因。本文着重对琼脂糖代谢的相关酶基因进行了预测和分析,发现16个琼胶酶。氨基酸序列分析表明,其中,有10个琼胶酶归类为GH86家族,4个为GH16家族,2个GH50家族。此外,还预测到了 4个GH117家族的糖苷水解酶基因 NABH4900、NABH4454、NABH4989 和 NABH4302,1个 AHGA 环化酶 AHGAC4986 和两个 AHG 脱氢酶 AHGD4985、AHGAC4649。基于这些相关的酶,本文预测了菌株WPAGA1将琼脂糖降解为可利用的单糖的完整代谢途径。(3)通过相关酶的重组表达与活性研究,对上述代谢途径进行了体外验证。结果表明,菌株WPAGA1基因组中的琼胶酶Aga4007、Aga2593、Aga4779、Aga950及Aga1974能将琼脂糖降解为新琼四糖及新琼六糖,随后这两种新琼寡糖被GH50家族的琼胶酶Aga2660降解为新琼二糖,新琼二糖被GH117家族的NABH4454降解为D-半乳糖及3,6-内醚-L-半乳糖(AHG),AHG被AHGD4985及AHGAC4986酶解产生KDGal,最后进入TCA循环,而D-半乳糖进入半乳糖代谢。此外,本文还发现,菌株WPAGA1基因组中具有丰富的硫酸酯酶基因。研究表明,重组硫酸酯酶(Su11971)能降解龙须菜中的粗琼胶产生游离的硫酸基团,与重组琼胶酶联合作用时,提高琼胶酶降解粗琼胶产生还原性寡糖的活性,表明硫酸酯酶在该菌株降解粗琼胶的代谢途径中起着重要作用。(4)在代谢途径研究的基础上,本文通过不同酶基因的组合表达,以定向制备不同组分的新琼寡糖。利用含Aga4007及Aga2660酶基因的重组质粒pACY-NAB1,在大肠杆菌BL21(DE3)中制备新琼寡糖,当以琼脂糖为原料时,能定向获得新琼二糖,产量约为500 mg/L。但以龙须菜粗琼胶为原料时,产生的新琼二糖浓度较低,约为50 mg/L。为了能够直接以龙须菜琼胶为原料进行生产,以降低成本和污染问题进一步将含硫酸酯酶Su11971的重组质粒pET-Sull以及含Aga4007及Aga2660酶基因的重组质粒pACY-NAB1同时转入大肠杆菌BL21(DE3)中,再以龙须菜粗琼胶为原料进行生产时,新琼二含量提高了 9倍,可达450mg/L。该方法为将来利用基因组数据充分挖掘菌株WPAGA1的应用潜力奠定了基础。