分枝杆菌快速鉴定体系的评估及常见非结核分枝杆菌耐药突变的检测

【摘要】：结核分枝杆菌位居全球十大死亡病因之列,虽然非结核分枝杆菌在全球的感染率次于结核分枝杆菌,但是由于其治疗方法与结核分枝杆菌不同,菌种鉴定方法的局限性和耐药率的逐年增加,导致其在临床上的发病率显著上升,因此,对分枝杆菌进行准确的菌种鉴定和耐药检测显得十分重要。此外,脓肿分枝杆菌复合群是目前致病性最强和对化疗药物耐药性最强的快速生长分枝杆菌,近期研究表明该复合群能在人与人之间传播,该复合群中的3个亚种对主要的治疗药物(如克拉霉素)具有不同的耐药性,因此,对该复合群进行亚种鉴定对临床治疗具有指导意义。第一章,首先,简要地介绍了分枝杆菌的生物学特征和全球流行病学概况,其次,介绍了目前分枝杆菌常见的菌种鉴定方法,以及本实验室已建立的常见分枝杆菌快速鉴定方法,然后,对脓肿分枝杆菌复合群的分类学演变过程和菌种鉴定方法进行了概括,最后,对常见非结核分枝杆菌的耐药产生机制和耐药检测方法进行了总结。此外,还归纳出了本论文的研究目的、研究内容和意义。第二章,我们用812份疑似肺结核病患者的临床痰液样本来评价本实验室建立的MeltPro Myco体系直接检测临床痰液样本的效果,并与验证方法对比,结果表明,在本体系检测出的14种分枝杆菌中,除了结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌复合群和偶然分枝杆菌的灵敏度分别为78.0%(255/327)、88.5%(23/26)、93.8%(15/16)和75.0%(3/4),其余10种分枝杆菌的灵敏度均为100%,并且,14种分枝杆菌特异度均≥99.9%,效果良好。其次,我们检测了 MGIT960系统培养为阳性的275份液体培养样本,其准确度为99.6%(274/275)。此外,我们将812份临床痰液样本的MeltPro Myco体系检测结果与其经过培养后的菌种鉴定结果进行对比分析,MeltPro Myco体系的灵敏度为81.4%(342/420),特异度为 100%,准确度为 90.4%(734/812),Kappa 值为 0.809,而 MGIT 960 系统的培养阳性率为65.0%(273/420),特异度为99.5%(390/392),准确度为79.4%(645/812),Kappa值为0.637,本体系的检测效果显著更好。所以,MeltPro Myco体系能基本满足临床上痰液样本直接检测的需求,有望被大力推广。第三章,本章建立了单管3色的脓肿分枝杆菌复合群亚种鉴定体系,分析灵敏度为1×100copies/μL,特异性和稳定性均良好。我们检测了 234份临床液体培养样本,以rpoB基因测序和多基因联合测序为对照方法,结果表明,本体系检测MASA、MASM和MASB的灵敏度分别为99.3%(139/140)、100%(88/88)和100%(2/2),特异度分别为 100%(90/90)、99.3%(141/142)和 100%(228/228),准确度为99.6%(229/230)。本体系可用于临床脓肿分枝杆菌复合群液体培养样本的亚种鉴定,有望在临床上推广。第四章,本章建立了单管4色的常见非结核分枝杆菌耐药突变检测体系,分析灵敏度为1×100 copies/μL,特异性和稳定性均良好。我们检测了 179份临床脓肿分枝杆菌复合群液体培养样本,以AST为金标准,检测获得性克拉霉素耐药的灵敏度为71.4%(5/7),特异度为100%(172/172),检测诱导性克拉霉素耐药的灵敏度为100%(77/77),特异度为97.0%(99/102),本体系的准确度为98.3%(176/179),Kappa值为0.966。本体系检测的样本量较少,后续我们将收集更多的临床样本来对体系进行更准确的临床评估,将更多的NTM纳入体系进行耐药突变检测,为临床提供可靠的NTM耐药筛查手段。