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分子自组装固定DNA和DNA与其他分子的相互作用及应用

周剑章  
【摘要】: 随着人类基因组计划(HGP)的顺利实施,人类基因组的工作草图提前绘制成功,人类在生命科学领域的认知又前进了一大步。然而在知道基因图谱之后,接下来的问题是面对大量的基因或基因片断序列如何研究其功能,研究重点便是要搞清楚基因变体的生物学功能及其对生命、健康和疾病的意义。各种重大疾病的易感基因以及这些基因之间的相互作用关系,将是研究的重中之重。因而对DNA与其他分子相互作用的基础研究变得越来越重要。另一方面,利用基因检测来进行基因诊断和基因治疗迫切需要研制开发各种适用于不同使用环境下的或快速灵敏或高密度高通量或方便廉价的基因传感器、基因芯片。 要构筑基因传感器、基因芯片(包括光学、电化学和压电传感器或芯片),首先必须先将与待测的靶分子碱基序列互补的DNA探针固定到固体表面上,构筑一个DNA识别层(DNA recognition layer),然后才能进一步进行根据碱基互补原理通过杂交反应检测其互补片段。DNA探针的固定化是制备基因传感器(芯片)的主要内容之一。 在本论文工作中,我们提出了使用自组装的聚二烯丙基二甲基氯化胺(PDDA)单层膜来固定DNA的新办法,用XPS、红外漫反射、拉曼和STM技术进行了表征。XPS、红外漫反射光谱、拉曼光谱、STM和电化学实验均表明DNA可以成功固定化到到PDDA自组装膜上。STM图像还表明单晶金电极上PDDA自组装膜是呈二维有序的线条状分布,随后吸附的DNA可顺着该结构进行固定化,也具有一定的有序性。该固定化DNA的方法不仅可以用于制备用于电化学DNA传感器,同样也适用于其他类型的DNA传感器。由于PDDA自组装单层膜具有的一定的纳米有序性,使得其不仅可以用于制备DNA传感器,还有可能进一 步用于开发高密度高通量的DNA芯片。 我们还首先尝试了在金电极上用直接吸附的办法形成聚乙烯亚胺 (PEI)自组装单层,并将其用于DNA的固定化。XPS、红外漫反射和 拉曼光谱实验均证明了PEI在金电极卜的自组装,以及DNA在PEI自 组装膜卜的吸附。STM图像表明了PEI自组装膜是个表面具有多孔洞的 结构。 通过对两种聚电解质自组装膜固定化DNA的比较,我们发现PEI 自组装膜虽然也不失为~种可行的DNA固定化方法,可应用于DNA传 感器的制备和 DNA电化学研究,但是,相对而言,PDDA自组装单层膜 具有电子传递性能更好、表面更加有序的优点。 在研究聚电解质自组装固定化DNA技术的同时,我们还提出一种 新的采用氧化铝膜板构筑高密度DNA阵列的方法,并用XPS、红外漫 反射、拉曼和AFM技术进行了初步的表征。 我们应用m加自组装膜电极研究钻邻菲咯琳配合物K叶吵enU‘”’‘” 与电极上吸附的mA相互作用,分析了*山的enU‘““”与电极上修饰的 dSDNA和SSDNA不同的相互作用模式,同文献的结果相符合。说明可以使 用PDDA自组装膜电极来研究DNA与其他分于相互作用的电化学行为。根 据[Co(phen)丁-““与 dsDNA和 SSDNA由于不同的相互作用模式,而出现的 不同电化学行为,我们提出一种用以表征DNA分于杂交的电化学标记法, 例如控制合适的电位,通过杂交前后电流的明显变化与否来判断杂交与 否,电化学标记法提供了一种DNA传感器或芯片电读出的方法。实验结 果也表明,采用氧化还原电对*b加n*’”‘’”作为标记物种,叫加自组 装膜电极可以用于制备电化学标记的DNA杂交传感器。 我们还采用PDDA和PEI自组装膜电极考察了两种染料分子硫董和亚 甲基蓝(MB)作为电化学标记物的可行性。线性扫描伏安图中,MB在dSDNA ·互互· 和 SSDNA修饰电极上给出的阴极电流峰具有显著的差异:微分脉冲伏安 图中,硫童同杂交前后的DNA相互作用后所给出的阴极电流峰有明显区 别。结果表明,两种染料分子均可作为标记物构筑DNA电化学传感器。 我们还通过电化学方法和拉曼光谱对MB与DNA相互作用的模式进行了研 究,提出:皿主要是以嵌入模式与电极表面的灯mA相互作用:而棚 与电极表面的 S SDNA的相互作用可能是较复杂的混合模式。 利用 MB作为电于传递探针,通过分析MB在dSDNA和 SSDNA在 PDDA自组装膜上的电极反应,我们认为长链DNA在PDDA 自组装膜 卜应该以平躺的方式吸附;通过分析MB在裸金、PDDA、dSDNAff,DDA 和 SSDNATDDA膜上的反应速率常数,发现SSDNA的电子传递性能优 于dSDNA,并提出DNA修饰电极的电子传递主要以横穿链方向进行的 电子传递模式。 ·二二二.


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