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甜菊(Stevia rebaudiana Bertoni)钙调蛋白基因的克隆、表达及绿色荧光蛋白基因转化甜菊的研究

熊玲媛  
【摘要】: 甜菊(Stevia rebaudiana Bertoni)是一种新型糖源作物,其糖苷具有高甜度、低热能、易溶解、耐热、稳定等特点,已成为继蔗糖、甜菜糖之后的第三种天然糖源植物,广泛用于食品、医药等行业。但是由于甜菊是自交不亲和、异花授粉作物,极易杂交导致品质退化,自70年代引种至今,我国甜菊品种严重退化,糖苷含量、口感均远远低于日本的品种。因此,在培育高产、优质、高糖苷含量、抗逆的新品种的研究中控制甜菊糖苷合成相关酶的表达及活性成为目前亟待解决的问题。在钙信号系统中,钙调蛋白(calmodulin,CaM)通过与Ca~(2+)的结合而激活一系列的靶酶和非酶蛋白质,控制细胞正常的生长发育及细胞对外界环境变化的反应。本文是对下列研究内容的总结:甜菊CaM基因的克隆、测序及结构分析;甜菊CaM在大肠杆菌中的表达;盐胁迫对甜菊钙离子浓度的影响;绿色荧光蛋白植物双元表达载体的构建及在甜菊细胞中的表达等等。 具体结果如下: 甜菊CaM基因的克隆及结构分析:从甜菊顶芽和花芽中提取总RNA,逆转录合成cDNA第一链,以此为模板,参考GenBank上已发表植物的钙调蛋白基因序列合成5′端和3′端引物,利用多聚酶链式反应(PCR)扩增并克隆得到了甜菊钙调蛋白基因的两个异型基因。序列分析表明,它们均由450个核苷酸组成,编码148个氨基酸。在核苷酸序列上与迄今已知的多种植物调蛋白基因均有很高的同源性,同源率在83%以上,编码的氨基酸序列同源性更高,同源率高达95%以上。这两个基因之间存在差异,其核苷酸序列同源率为85%,编码区的氨基酸序列的同源率为99%,仅在第122个氨基酸由ALA代替了VAL。对CaM基因的初步分析表明CaM是一种在进化过程中非常保守的蛋白质,它在生物的代谢和生长发育过程中是必不可少的。 甜菊CaM基因在大肠杆菌中的表达:甜菊CaM基因克隆至表达载体PET-28a(+)中,得到含有正确阅读框架的表达质粒PLC,转化到表达菌BL21(DE3)中,用煮沸法提取蛋白质,SDS-PAGE结果表明:IPTG诱导过的BL21/PLC提取物比不加IPTG诱导的BL21/PLC提取物及仅含空载体PET-28a(+)的BL21/PET-28a(+)提取物多一条21kD左右的条带,该蛋白占细菌提取物总蛋白的20%左右。用自制的小鼠抗花椰菜CaM血清作一抗,Western Blot结果显示只有该条带与小鼠抗花椰菜CaM抗体发生特异性结合。表达产物经Phenyl-sepharose CL-4B亲和层析柱纯化后,得到纯化的工程蛋白,SDS-PAGE结果显示该工程蛋白分子量大小也为21kD左右,Western Blot结果显示该工程蛋白与小鼠抗花椰菜CaM抗体发生了特异性结合。 盐胁迫对甜菊钙离子浓度的影响:用低温负载法以酯形式负载Fluo-3,结合荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微系统(LSCM)观察测定,发现不同浓度的 NaCI臼0上00 mmoUL)均能够引起甜菊愈伤组织原生质体内游离Ca卜浓度的迅 速升高,这种升高作用呈现剂量依赖性。在用L汇1预先处理原生质体的情况下, 这种盐胁迫效应会受到抑制,而肌醇又能修复这种盐胁迫效应,表明NaCI可能通 过激活肌醇磷脂调节系统引起原生质体内CaD浓度升高,C/”浓度升高作为一种 盐胁迫信号激活钙信号系统其它成员,进而通过激发一系列生化反应,如有关酶 的生物合成等,调整细胞对外界环境变化的适应性。 绿色荧光蛋白ureen luorescent protein,GFP)植物双元表达载体的构建: 为了能在植物中表达GFP,通过PCR扩增将改良的GFP基因GFP-mutZ连入到 中间载体 pBPF Q 7,使之带上真核表达启动子 CaMV 355和 nos终止子及一个 65hp的增强子Q后,将其插入到植物双元表达载体pCAMBIA1301中,构建了 带有 GFP-mutZ的植物双元表达载体 130lpB Q G。 甜菊遗传转化体系的建立:利用构建的植物双元表达载体130lpB口G,在农 杆菌的介导下对甜菊愈伤组织进行了转化,用潮霉素(HYG)作为抗性筛选剂进行 筛选,对抗性愈伤组织进行检测,结果如下:Xgl[JC液染色显示双元载体上GUS 基因在甜菊细胞中已得到表达,PCR和 Southern Blot检测表明外源 GFP基因己 整合到甜菊愈伤组织的基因组中,抗性愈伤组织块在荧光显微镜和激光共聚焦显 微镜下可观察到较强烈的绿色荧光,表明GFP基因在转基因甜菊愈伤组织中己 获得了表达。从而建立了以绿色荧光蛋白基因为报告基因的、根癌农杆菌介导的 甜菊转基因系统。为今后构建GFP融合蛋白及分析相关蛋白的生物学功能奠定 了基础。


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