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豚鼠气单胞菌CB101中几丁质酶基因的克隆及其异源表达的全酶蛋白和酶片段的功能研究

周樱  
【摘要】: 豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)CB101能产生多种分子量不同的几丁质酶。根据已知几丁质酶基因的DNA保守序列,利用人工合成的PCR引物和CB101总DNA,扩增出一个约2.6kb的片段并克隆到pBluescriptⅡKS载体上。序列分析表明,这是目前已克隆的最大的微生物几丁质酶基因之一,命名为Chi1,编码865个氨基酸,蛋白质分子量为91.5kDa,从N端到C端依次包括N-末端信号肽序列,类PKD(Polycystic kidney disease,多囊肾)结构域,催化结构域,C端类REJ(Receptor for Egg Jelly,卵胶膜受体)区域和两个几丁结合区,是目前已知的最大的微生物几丁质酶中的一个。该酶降解胶体几丁质成几丁二糖、三糖和N-乙酰葡萄糖胺,具有几丁质外切和内切双重功能。其N端563个氨基酸序列(Chi 1~-,包括信号肽、PKD结构域和催化区)与粘质沙雷氏菌[Serratia marcescens]Chi A高度相似(74.29%),经同源建模,构建了Chi 1部分空间结构模型。进而对Chi 1和Chi 1~-做了体外表达、纯化及功能的比较分析,首次揭示了几丁质酶潜在的几丁结合区对酶作用底物与产物的特异性影响,即Chi 1~-仍具有较强活性,但其胶体几丁质降解产物为几丁二、三、四糖。进一步的实验也证实全酶的最低分子量底物为几丁三糖,而去除C端的酶片段的最低分子量底物为几丁四糖。


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