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泥鳅对创伤急性反应的功能蛋白质组学研究

吴亚君  
【摘要】: 研究背景:几乎所有动物受到创伤和感染等外界伤害时都会启动急性反应系统(acute phase response,ARP)进行快速的自我保护,包括抵御微生物的入侵,促进创伤的修复,帮助机体恢复正常静息状态等,其中涉及众多蛋白质(APP)水平的变化。APR的研究在哺乳动物中有较多的报道,研究成果多涉及人类医疗领域。低等生物在更大程度上倚赖APR的保护作用,例如鱼类就是一种很好的APR研究模型。蛋白质组学的发展为APR的研究带来了快速,高灵敏度,高分辨率,高通量的研究方法,其从整体的角度研究APR体系并可以快速鉴定候选APP的能力是其它方法所不具备的。 研究目的:研究泥鳅创伤后血清和皮肤蛋白质组的变化情况,鉴定APR候选蛋白,寻找其中具有特殊研究价值的活性蛋白,进行功能上的鉴定。 研究方法:采用双向电泳技术获取泥鳅创伤前后血清和皮肤的小分子蛋白图谱,利用基质辅助激光解析飞行时间检测质谱分析(matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)和电喷雾离子化串连质谱分析(electrospray ionization ms/ms,ESI-MS/HS)分别获得差异蛋白点的肽指纹图谱(peptide mass of fingerprint,PMF)和部分序列信息,通过互联网上的ExPAsy服务器中和NCBI的相关软件将这些信息和SwissProt数据库进行匹配鉴定蛋白质种类。对其中感兴趣的angiostatin类蛋白采用离子交换层析获取初步纯化产物并采用鸡胚绒毛尿囊膜模型检测其功能。 研究结果:建立了血清和皮肤小分子双向电泳参考图谱,以此为基础鉴定了创伤前后发生明显变化的26个蛋白质,其中血清10个,皮肤16个。采用MALDI—TOF—MS获得这些蛋白的PMF图谱,并通过ESI-MS/MS获得其中9个蛋白的部分氨基酸序列。数据库搜索鉴定了其中的22个蛋白质,结果发现3个血清蛋白和5个皮肤蛋白为已知的APR蛋白。其它13个蛋白部分根据已知的功能可以推断它们在APR中的作用或者表达发生变化的原因,部分蛋白的变化原因尚无法推测。对angiostatin类蛋白的功能鉴定结果发现在一定程度上可以抑制A459肺癌细胞培养上清对鸡胚尿囊膜血管生长的促进作用。 结论:蛋白质组学为APR领域带来高效率高通量的研究方法,改变了传统的ELISA方法需要事先确定靶蛋白的低效的,而且难以发现新蛋白的状况,也克服了suppression subtractive hybridizaition(SSH)技术固有的假阳性,实现了对APP候选蛋白快速的鉴定。


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