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汞结合金属硫蛋白表征方法和铅同位素比值电感耦合等离子体质谱测定方法的研究

黄志勇  
【摘要】: 朱砂,作为一种天然矿物药,在我国传统中药(TCM)中被广泛使用,经过两千多年的临床实践证明它具有显著疗效,但对朱砂的毒性及其使用安全性的争论却始终未曾间断。基于此,本文通过灌喂朱砂后大鼠各脏器对汞的蓄积行为及体内诱导金属硫蛋白的特性进行该药物的毒性及使用安全性研究。 本学位论文包含两个部分,第一部分包括从第一至第四章,建立了几种表征灌喂朱砂大鼠金属硫蛋白(MTs)的方法;第二部分包括从第五至第八章,介绍了用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定铅同位素比值及其应用的方法研究。 MTs是一类富含半胱氨酸的小分子蛋白质,在生物体中具有抗重金属的解毒功效,利用这一特性,可用作评价灌喂朱砂大鼠汞毒性的生物标识物。第一章通过100多篇参考文献综述了MTs的基本知识,包括:MTs的起源、结构特征、生物功能、传统的测量方法和现代联用技术的表征方法。 在第二章中,分别用电感耦合等离子体质谱法和汞结合金属饱和法分别测定了灌喂朱砂大鼠的各脏器如肝、肾、心、脑和睾丸中的重金属(包括汞、铜和锌)和MTs总量,并对脏器中重金属含量和MTs总量之间的相关性进行讨论。结果表明:灌喂朱砂后大鼠各脏器对汞均有一定程度的蓄积作用,尤其是在肝、肾和睾丸中汞的积累程度特别显著。当灌喂大剂量朱砂或进行长时间灌喂后,则朱砂的汞毒性将十分显著,甚至是致命的。研究发现大鼠中肝脏和肾脏的汞含量和MTs总量之间均存在着高度的相关性,因此,MTs可作为朱砂毒性、安全性研究的生物标识物。 基于凝胶色谱(SEC)和ICP-MS的联用技术,第三章介绍了用该联用方法对灌喂朱砂和HgCl_2大鼠中诱导生成的多金属结合MTs组分进行在线分离分析。结果表明:灌喂朱砂大鼠各脏器中生成的Hg结合MTs组分均比灌喂HgCl_2组的少;随着灌喂时间的延长和灌喂剂量的加大,朱砂组大鼠的肾中Hg-MTs组分的 Abstract:Charaeterization ofmereury一bindingmetallothio耽ins(MTs)andmeasurementofleadisotoPie ratios with induetively couP!曰Plasmam哪印郎如me妙(Ic卜MS) 诱导量也随之显著增加,与此同时,肾脏中Cu一MTs的诱导量也显著增加。MTs 变化的结果说明了其在肾脏重金属中毒中发挥着重要的解毒作用。而Hg一MTs组 分在肝脏中的诱导量似乎与灌喂剂量大小(2.5一5.0 g/Kghw)和灌喂时间长短(冬4 周)无关,但其在朱砂组的诱导量皆比对照组显著增加。本章还比较讨论了在灌喂 朱砂组、H解l:组和对照组的大鼠其它脏器中Hg,MTs组分的诱导量和变化规律。 第四章,建立了包括用反相液相色谱法(rp·HPLc)分别与电感祸合等离子 体质谱(IcP一MS)和电喷雾电离质谱(ESI一MS)联用的方法对大鼠中汞结合金 属硫蛋白的不同存在形态进行表征。样品经葡聚糖凝胶柱(SePhadex G-75)分离 后再经透析(Ml 000 Da)除盐,大鼠的肾脏、肝脏中的MTs提取物用细内径的 反相色谱柱进行分离,并进行梯度洗脱。洗脱液经ICP一MS在线检测,可分析与 不同金属结合的MTs亚型、次亚型的结构信息。通过rpHPLC一Esl一Ms联用,可 获得MTs多形态的紫外(UV)和ESI一MS的总离子流(TIC)色谱图。由于日前 有关Hg一MTs形态的Esl一MS分析报道极少,且缺乏Hg一MTs及其亚型的标准参 考物质,因此,Hg一MTs亚型及次亚型的分子结构只能通过Tlc色谱图中各碎片 峰相应的质量数及参照文献报道的有关脱金属MTs(aPO一MTs)的质量数进行推 断。实验结果表明,大鼠经灌喂Hgcl:后其肾脏诱导生成了汞结合金属硫蛋白, 且存在多金属结合的几种MTs形态。由于肝脏的Hg一MTs诱导量少且Esl一Ms检 测的灵敏度相对较低及一些未知因素,因此无法对肝脏的Hg一MTs的形态进行结 构表征。 虽然同位素比值的测量通常都用热电离质谱(TIMS)、火花源电离质谱 (sSMs)或二次电离源质谱(sIMs),但基于四极杆分离的电感祸合等离子体质 谱(ICP一QMS)以其简便、准确的优点,也是目前进行元素同位素比值的理想测 量工具,从而可利用同位素稀释(ID)法准确测量元素的浓度。在第五章中,通过 查阅大量的参考文献,介绍了影响ICP一MS测定同位素比值准确度、精密度的主 要因素,如由等离子体系统、四极杆质量分析器和检测器等产生的同量异位素离 子、多原子分子离子、质量歧视现象、死时间和仪器操作参数等,及校正、消除 摘要:汞结合金属硫蛋白表征和铅伺位素比值电感祸合等离子体质谱测定方法的研究 相应各干扰因素所采取的方法。基于JCP一MS对同位素比值的准确测量,可利用 同位素稀释法对元素浓度进行精确定值。为考证同位素稀释测量方法的优点,用 IcP一Ms测量了植物、人发标准参考物质中的铅同位素比值,进而用同位素稀释 法钡l定其中的铅含量,实验测量值与标准物质的铅参考值十分吻合。 第六章介绍了用同位素稀释的ICP一MS测定食用CaC03中痕量铅的方法。样 品经过阴离子交换法除去CaCO3基体,再以Tl作为内标校正质量歧视现象,川 同位素稀释及JCP一MS测定样品中铅的含量。以空白测量值的3倍标准偏差(即 3X。)作为本测量方法的最低检出限,为2.944ng/mL。加标回收率为


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