农作物和植物源食品中转基因成分的检测技术研究

【摘要】： 转基因生物(又称基因修饰生物，genetically modified organisms，GMO)，指用基因工程技术或者其他现代生物技术改变基因组构成的动物、植物、微生物。转基因植物是发展最迅速、应用最广泛的转基因生物。近年来，越来越多的目的基因将被转入种类更加繁多的作物中，GMO的数目和复杂性不断增长；越来越多的GMO已进入我国，而我国的非转基因农产品也急需走出国门。 尽管世界各国对于转基因生物及其产品的安全性还有很大的争议，管理法规也存在差异，但加强GMO的研制、生产、监督、管理和检验成为共识。目前，与GMO检测有关的国际标准尚未出台，我国对GMO的检测也无统一的方法和标准。因此，尽快建立和完善GMO检测技术，是对GMO实施安全管理的基础，也是确保消费者的知情权和餐桌安全，以及农产品国际贸易健康发展的基础。本文研究农作物和植物源性食品中转基因成分的检测技术，目的在于发展GMO的定性筛选、鉴定分析和定量检测方法，为实施GMO检测与监管提供技术支持，也为最终建立快速、高效和准确的GMO标准检测方法提供依据。 本文应用生物信息学方法，通过各种途径获得了田间试验和商品化转基因农作物的主要信息，根据转基因农作物中最常用的外源DNA的序列特点，自行设计选择了多对引物及相应的探针。经过反复比较、证实，本文设计选择的引物与探针适用于GMO的实际检测。 在DNA提取方法研究的基础上，本文应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)及其衍生技术，利用大豆、玉米、水稻、马铃薯、甜椒等多种已知标准样品，建立了多种农作物和植物源性食品的GMO定性、半定量和定量检测方法： 1、在单基因定性检测技术方面，针对现有的商品化GMO中大多数含有花椰菜花叶病毒35S(CaMV 35S)启动子和胭脂碱合成酶基因(Tnos)终止子的特点，本文建立了CaMV 35S启动子和Tnos终止子的定性PCR筛选检测方法。 选用针对CaMV 355启动子和丁nos终止子序列的特异性内切酶为刀n!和八污矛! 对阳性扩增产物进行酶切确认，并首次将表面等离子共振生物传感器技术应用于 GMO定性PCR检测的快速验证，即将末端生物素修饰的ssONA探针固定在传 感器芯片表面，通过BiacoreX仪直接现场测定探针与PCR产物的专一性杂交 而产生的光信号的变化过程。本文报告的GMO表面等离子共振生物传感器方法 为实现GMO检测的自动化提供了一种新的思路。 2、在多基因定性检测技术方面，本文在优化并确定了多基因PCR反应条 件的基础上，采用了两种方法对多基因PCR产物进行鉴定:①采用共价结合方 法将多个探针(标记氨基)固定在Biodyneoc膜上，将5’端标记生物素的多基 因PCR产物与膜上的探针进行杂交及显色反应，首次建立了GMO的多基因 PCR一膜相杂交检测方法，实现了一个反应体系中同时检测多种转基因成分的目 协 ................… 提高了检测效率与准确率。②利用自行处理获得的异硫氰酸基修饰的国产玻 确定了芯片制备条件， 标片 芯片;待检样品经多基因 通过全自动芯片点样仪制备了转基因检测低密度基因 PCR扩增及用荧光染料标记的三磷酸脱氧胞昔进行荧 光标记，优化了芯片探针与PCR产物的杂交反应条件，杂交后的芯片进行扫描 分析，建立了高通量、自动化的低密度基因芯片检测方法，为实现GMO的高效 检测提供了一个有力的武器。 3、在半定量检测技术方面，本文首次建立了GMO的PCR一EUSA液相杂 交半定量检测方法，即优化并确定了PCR一酶标板杂交反应条件，将5’端标记生 物素的PCR产物与5’端标记地高辛的探针呈液相混合，在PCR管中原位进行 液相杂交，杂交产物通过链霉亲和素被固定在酶标板孔表面，然后进行EUSA 测定。本文报告的GMO PCR一EUSA液相杂交方法使扩增与杂交反应在同一 尸CR管中完成，有利于实现操作自动化和结果数值化。 4、在定量检测技术方面，本文分别选择了内源基因大豆植物凝集素(Ieotin)、 玉米转化酶(i nvertase)和外源基因CaMV 355、抗草甘麟除草剂的5一烯醇式 丙酮酞莽草酸一3一磷酸合成酶(cp4epsps)、抗欧洲玉米螟的苏云金芽饱杆菌 杀虫毒蛋白(c ryIAb)、Tnos的三种荧光探针(分子信标探针、TaqMan探针和 荧光双链探针)，优化了探针浓度、镁离子浓度以及变温曲线、杂交曲线等反应 参数，在PCR反应过程中分别以JOE(或TET或HEX)和FAM两种荧光通道 信号分别追踪同一样品ONA的内源基因和外源基因的扩增动力学变化，以二者 的循环阑值之差对GMO系列浓度梯度标准品制成定量标准曲线，建立了GM大 豆和GM玉米的三种荧光定量PCR检测方法，实现了对GMO的准确定量分析， 基本达到了操作自动化和过程标准化的要求。其中分子信标一荧光定量PCR方法 具有特异性较高、荧光阂值较低的特点;TaqMan一荧光定量PCR方法具有探针 设计较简便、成本较低的特点;荧光双链探针一荧光定量PCR方法具有特异性高、 荧光闭值低、成本低的特点。本文还利用荧光双链探针的特点，创立了一个反应 管中同时筛选检测CaMV 355和Tnos两种转基因成分的多基因荧光定量PCR 方法，该