A、O型口蹄疫双价疫苗研究

【摘要】：口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的烈性传染病。由于猪、牛、羊等主要家畜均可感染此病，并能形成大规模地流行，所以国际兽疫局将该病列为A类家畜传染病之首。FMDV有七种血清型，目前我国以O型FMDV为主，A型FMDV也时有发现。研制抗A、O型FMDV的双价疫苗具有极其重要的意义。本研究主要包括研制大肠杆菌、酵母表达的A、O型FMDV双价多肽疫苗；制备A、O型FMDV双价DNA疫苗及如何提高DNA疫苗的免疫效果等内容。现将具体结果总结如下： 1．大肠杆菌表达的A、O型FMDV双价多肽疫苗：根据A、O型FMDV的序列，兼顾大肠杆菌、酵母等本实验涉及的几种生物的密码子偏向性，设计A、O型FMDV抗原决定簇序列。将该序列与HBcAg cDNA相连接以增强其免疫原性。将此融合蛋白基因克隆至大肠杆菌原核表达载体pET28a中，序列测定证明其阅读框架正确。转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达。经SDS-PAGE电泳分析发现，阳性克隆经IPTG诱导后比对照多出一条分子量约为33 KD的蛋白条带。该表达蛋白以包涵体的形式存在。经Ni~+-NTA-Sepharose 6B柱纯化后，蛋白纯度达95％以上，该纯化蛋白经MALDI-TOF质谱分析证实确为构建之融合蛋白基因的表达产物。免疫小鼠后能检测到特异抗体的产生。 2．毕氏酵母表达的A、O型FMDV双价多肽疫苗：将A、O型FMDV抗原决定簇与HBcAg的融合蛋白基因，与酵母表达载体pPIC 9K连接，转化酵母细胞GS 115，Southern Blotting分析证明目的基因已整合至酵母基因组中；经1％甲醇诱导表达分子量为37 KD的重组蛋白，Western Blotting分析其具有免疫原性。 3．A、O型双价FMDV DNA疫苗：将A、O型FMDV抗原决定簇与HBcAg A、O型口蹄疫病毒双价疫苗的研究 的融合蛋白基因，与真核表达载体peDNA3连接，体外转染实验证明该 基因能在哺乳动物细胞中表达。该DNA疫苗免疫小鼠，能诱导特异抗体 产生和T细胞增殖。 4.以IL一lp 163一171九肤编码序列作为基因佐剂:将IL一lp 163一171九肤编码 序列与FMDV DNA疫苗连接，免疫小鼠后，与仅注射FMDV DNA疫苗 组相比，抗0、A型FMI)V抗体分别增加约4倍。经A、O型FMDV蛋 白刺激后提高T细胞增殖约2倍。 5.以止一2编码序列作为基因佐剂:IL一2编码序列与DNA疫苗是否注射于相 同部位，直接影响其基因佐剂效果。IL一2与DNA疫苗融合表达能使抗O、 A型FMDV抗体分别提高约8倍;A、0型FMDV蛋白特异的T细胞增 殖应答提高约2倍。IL一2基因佐剂与DNA疫苗注射于相同部位能使抗0、 A型FMDV抗体增加约4倍:提高T细胞增殖应答约2倍。但是如果IL一2 基因佐剂与DNA疫苗分别注射于不同部位，不能发挥其免疫增强效果。 6.以IL一4编码序列作为基因佐剂:无论以何种方式与DNA疫苗连用，IL-4 基因佐剂都不能显著促进抗体的产生。IL一4编码序列与DNA疫苗融合表 达提高A、0型FMDV蛋白特异的T细胞增殖约3倍、IL一4基因佐剂与 DNA疫苗注射于相同部位能使T细胞增殖应答提高3倍。但是IL一基因 佐剂与DNA疫苗分别注射于不同部位，对T细胞增殖应答效果不明显。 7.以姬松茸多糖提取物作为佐剂:姬松茸多糖可以使A、O型FMDV特异 抗体产生分别提高约4倍;T细胞增殖应答提高约2倍。