杂色鲍血细胞和体液免疫因子研究

【摘要】： 本论文致力于研究病原和非病原细菌的入侵引起杂色鲍(Haliotis diversicolor)血细胞免疫功能和体液免疫因子的变化,从形态与功能对鲍的血细胞进行分类,研究了鲍血细胞吞噬细菌的过程,探讨了鲍血细胞和体液免疫系统对病原弧菌和非病原细菌及其胞外产物(Extracellular products,ECP)的不同防御机制,阐述抗生素对杂色鲍血细胞免疫功能的影响。主要的研究结果包括3个部分: 第一部分杂色鲍血细胞的形态观察和功能研究 1.首次以血细胞在抗凝剂中的死亡率和凝集情况为指标,对实验室自行配制的3种鲍血淋巴抗凝剂和其它6种无脊椎动物血淋巴抗凝剂进行了筛选。结果表明,在自行配制的抗凝剂HA1和RH中的鲍血细胞分布均匀,6h内死亡率均低于6%,24h死亡率均未超过33%,抗凝效果最佳。 2.首次根据血细胞的形态结构结合其细胞核质比和免疫功能特点将杂色鲍的血细胞分成3类:一类血细胞为7.1~8.6μm×7.8~9.2μm,核质比均值1.39,细胞质中一般仅见线粒体以及杆状、椭圆状和中空状的丰富颗粒,可吞噬细菌和酵母,NBT还原反应阴性的颗粒细胞(Ⅰ型);二类血细胞为6.7~8.1μm×7.1~8.3μm,核质比均值1.82,细胞质无颗粒且富含内质网,可吞噬细菌和粘附酵母,具有NBT还原能力的透明细胞(Ⅱ型) ;三类血细胞为4.56~6.49μm×3.82~5.75μm,核质比均值为3.24,细胞质中有较多的线粒体,没有吞噬功能也不还原NBT的类淋巴细胞(Ⅲ型)。 第二部分杂色鲍离体血细胞的免疫功能及其影响因子的研究。 1.首次研究了2种病原弧菌(F3602和X4302)和非病原大肠杆菌(Escherichia coli)菌液对腹足类离体血细胞产生活性氧、吞噬活性、溶酶体膜的完整性和趋化性4项免疫功能的影响。结果表明,与浓度相同的E.coli菌液相比,2种弧菌抑制了离体杂色鲍血细胞产生活性氧,但差异不显著;严重破坏了血细胞溶酶体膜(P0.05);菌液浓度同为2.1×107cfu/mL时,血细胞对F3602和X4302的趋化距离分别是E.coli的1.69(P0.05)和1.57倍;血细胞对浓度为6.3×107cfu/mL的2种病原弧菌的吞噬作用显著大于对同一浓度E.coli的吞噬(P0.05)。 2.首次报道菌ECP对腹足类离体血细胞免疫功能的影响。蛋白浓度为30mg/L的2种弧菌ECP对杂色鲍血细胞溶酶体膜的破坏性远高于E.coli ECP(P0.05);蛋白浓度同为7.5mg/L,X4302和F3602 ECP导致血细胞的趋化性高于E.coli ECP,其中F3602 ECP组与E.coli ECP组血细胞的趋化性差异显著(P0.05);蛋白浓度同为30mg/L时,F3602 ECP组血细胞对F3602的吞噬活性明显地大于E.coli ECP组(P0.05);在同一浓度下,加入2种弧菌ECP后血细胞产生的活性氧少于E.coli ECP组,但差异均不显著。 3.首次研究了抗生素对离体贝类血细胞免疫功能的影响。结果表明,与生理盐水对照组相比,链霉素对离体杂色鲍血细胞溶酶体膜破坏作用微弱,略微抑制血细胞的趋化性,提高血细胞活性氧的作用不明显(P0.3),浓度≧50μg/mL的链霉素显著促进血细胞对F3602的吞噬(P0.05),可做为养殖杂色鲍弧菌病的防治药物。浓度≧50μg/mL的新霉素显著抑制血细胞趋化(P0.05),对血细胞吞噬活性的促进作用不如链霉素,不宜用于鲍弧菌病的防治。氯霉素和壮观霉素对血细胞吞噬活性的促进作用不明显,严重破坏溶酶体膜(P0.05),浓度为100μg/mL时明显抑制血细胞产生活性氧(P0.05),浓度为100μg/mL和50μg/mL的2种抗生素作用下血细胞的趋化距离均明显缩短(P0.05),在养殖鲍弧菌病防治中均应被禁用。 4.15℃和30℃两组温度条件下,低温组的离体鲍血细胞在F3602及其ECP作用下,相对高温组呈现出溶酶体膜的稳定性加强,产生的活性氧减少,对F3602的吞噬活性增强,血细胞的趋化距离缩小。而在抗生素实验中,相对高温组而言,低温组的离体鲍血细胞产生的活性氧稍有波动,吞噬活性略有下降,除了浓度为100μg/mL的壮观霉素和新霉素组鲍血细胞趋化距离变大以外,其余实验组血细胞的趋化距离缩小,抗生素对溶酶体膜的破坏作用相对减轻。结果表明,低温条件可以减轻抗生素对血细胞溶酶体膜的破坏,更有利于贝类的免疫系统发挥作用。 第三部分病原弧菌和E.coli及其ECP感染对杂色鲍活体血细胞的免疫功能和体液免疫因子的影响研究。 1.经人工感染实验证实副溶血弧菌F3602及其ECP均可以导致杂色鲍死亡,48h和96h的半致死浓度分别为6.88×10~7cfu/mL、2.84×10~7cfu/mL和252.9mg/L、183.2mg/L。在低于48h半致死浓度的F3602和E.coli及其ECP感染健康杂色鲍后对活体血细胞的免疫功能和体液免疫因子的变化进行研究。对于F3602及其ECP而言,与注射生理盐水的对照组相比,菌液浓度≧8.7×10~7cfu/mL时F3602可导致杂色鲍活体血细胞的溶酶体膜被显著破坏(P0.05),趋化性被显著抑制(P0.05),活体血细胞产生的活性氧显著增加(P0.05),低浓度(5.8×106cfu/mL和8.7×106cfu/mL)F3602菌液显著促进血细胞对F3602的吞噬(P0.05)。高浓度的F3602 ECP(蛋白浓度为204mg/L)感染明显抑制杂色鲍活体血细胞产生活性氧(P0.05)和对F3602的吞噬活性(P0.05),极严重破坏血细胞的溶酶体膜(P0.01),明显提高血细胞的趋化性(P0.05)。对于E.coli及其ECP而言,注射高浓度的E.coli菌液明显促进了鲍血细胞对F3602的吞噬(P0.05),极严重破坏了血细胞的溶酶体膜(P0.01)。高浓度的E.coli ECP感染仅极显著增加了活体血细胞活性氧的产生(P0.01)。低浓度的E.coli菌液及其ECP(蛋白浓度为51mg/L)感染对血细胞的上述4项免疫功能几乎没有影响。 2.分析了F3602和E.coli感染杂色鲍48小时后血清中碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase,ACP)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)的比酶活改变。首次报道了菌ECP感染对贝类血清中的ACP、ALP和SOD酶活力的影响。结果发现,高浓度的F3602 ECP和F3602菌液感染可显著地抑制鲍血淋巴中SOD的活力(P0.05);鲍血淋巴中ALP的比酶活因注射低浓度的E.coli菌液和高浓度的F3602菌液而明显提高(P0.05);低浓度的E.coli菌液和低浓度的F3602 ECP(蛋白浓度51mg/L)感染可显著提高鲍血淋巴中ACP的比酶活(P0.05),ACP比酶活却因注射高浓度的F3602菌液而大大降低(P0.05)。 3.首次报道腹足类血清中存在与羊抗人抗血清发生特异性反应、类似人IgA、IgG和IgM的类抗体。结果表明,细菌感染前杂色鲍血清中类IgA、类IgG和类IgM含量在64～71μg/mL之间,经浓度为8.7×10~6cfu/mL E.coli诱导后鲍血清中类抗体的含量大大增加,IgM为157.008±18.201μg/mL、IgG为100.252±6.870μg/mL、IgA为88.019±6.599μg/mL。细菌感染后IgM含量和其他动物及人在一个数量级,IgA和IgG含量均比其他动物及人低1-2个数量级。4.首次比较了F3602和E.coli菌液及其ECP感染对贝类血清中类抗体含量的影响。低浓度的2种菌液和ECP均可使杂色鲍血清中类IgA的含量显著高于生理盐水对照组(P0.05);低浓度的2种菌液和浓度为51mg/L的E.coli ECP同样可以显著增加血清中类IgG的含量(P0.05)。但菌液及ECP对IgM抗体的诱导作用则表现为:低浓度F3602菌液组鲍血清中类IgM含量显著低于同浓度E.coli菌液组(P0.05),相反,高浓度F3602菌液组鲍血清中的类IgM含量显著地高于同浓度E.coli菌液组(P0.05)。与对照组相比,高浓度的F3602 ECP组鲍血清的类IgM含量显著下降(P0.05),低浓度的F3602 ECP和E.coli ECP分别导致血清中类IgM含量极显著增加(P0.01)和显著增加(P0.05)。