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养殖真鲷、黑鲷抗菌肽hepcidin的基因克隆、表达特性及其抗菌活性研究

杨明  
【摘要】: 抗菌肽(antimicrobial peptide)是一类具有广谱抗微生物活性的天然小肽类物质,是先天免疫系统中重要的非特异性免疫因子。Hepcidin是2000年首先从人类中发现的一类富含半胱氨酸、性质独特的抗菌肽,其不仅具有显著的抗微生物活性,还被认为是一种关键的铁代谢调节因子,在鱼类中分布广泛。本论文以我国重要的海水经济养殖鱼类-真鲷(Pagrus major)和黑鲷( Spagrus macrocephalus)为研究对象,较深入的研究了hepcidin抗菌肽的基因结构组成、器官、组织特异性分布、体外表达及其表达产物的抗菌活性,为开发应用hepcidin抗菌肽奠定基础。通过研究获得了如下结果: 1构建了真鲷鳃cDNA文库。以细菌攻毒的真鲷鳃为材料,提取并分离出mRNA,合成双链后,回收500bp~4,000bp cDNA片段,构建了λZAP表达型cDNA文库。初级文库的容量为1.75×105个重组子,扩增文库的滴度达到1×109pfu/mL,随机挑选重组克隆的插入片段在500~2000bp之间。根据已发表的hepcidin序列的保守区域设计特异性引物,以此引物做PCR扩增文库,获得了hepcidin抗菌肽基因cDNA片段(GenBank登录号为AY574220)。该cDNA文库的构建为分离和筛选抗菌肽及其它免疫相关基因奠定基础。2克隆获得了真鲷、黑鲷hepcidin基因与基因不同变体cDNA序列。利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增技术(RACE)从细菌感染后采集的养殖真鲷肝脏和鳃分离到2条hepcidin cDNA序列(GenBank登录号为AY557619、AY669383),从黑鲷的肝脏、脾脏、肾脏、鳃、皮肤和血液中分离出7条hepdidin cDNA序列(GenBank登录号为AY669376~82),每条cDNA序列均包含完整的hepcidin编码区及5′和3′非编码区,并且序列末端均具有明显的多腺苷酸化加尾信号。从推导的真鲷、黑鲷hepcidin氨基酸序列(84~95aa),发现它们都由信号肽、优势域(prodomain)和成熟肽三部分组成,都具有hepcidin典型的富含半胱氨酸的特点,在信号肽区域和成熟肽8个半胱氨酸的保守位点与已经发表的鱼类hepcidin具有较高的相似性。因此认为从真鲷、黑鲷不同器官、组织中分离到的9个hepcidin变体为hepcidin抗菌肽基因家族的新成员,广泛存在于真鲷和黑鲷的多种器官、组织中。


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