铜绿微囊藻生物钟蛋白的节律检测及其相互作用蛋白的筛选

【摘要】： 生物钟是广泛存在于蓝藻、植物和动物细胞中的内源计时系统,它对各种代谢和行为的实时调控使机体能更好地适应环境日变化(如光照、温度和湿度等)。生物钟一般具有三个主要特点,即在稳恒条件下生物钟仍然能以近似24h的周期自由运行;光/暗和温度信号能重置生物钟时相;生物钟周期长度具有温度补偿性。 蓝藻是具有生物钟的最简单生物,蓝藻生物钟的核心是kai基因簇及其编码的蛋白KaiA、KaiB和KaiC,这三种蛋白相互作用调节KaiC的磷酸化状态,从而产生昼夜节律信息。KaiC的磷酸化循环是昼夜节律的起搏器,调控包括kai基因在内的相关基因的节律性表达。 为了研究铜绿微囊藻中Kai蛋白的表达节律,我们将三种kai基因分别构建到pET-His中进行原核表达,表达产物经纯化后免疫小鼠,分别制备了抗KaiA、抗KaiB和抗KaiC的抗血清,并利用这些抗血清对藻细胞中的KaiA、KaiB和KaiC的表达节律进行了检测,结果表明,在Microcystis aeruginosa PCC7820中KaiA蛋白含量在昼夜周期的各个时相都保持较高含量,不呈明显的昼夜节律变化;而KaiB和KaiC蛋白含量及KaiC的磷酸化过程则呈现明显的昼夜节律性,其中KaiB含量与KaiC含量及KaiC磷酸化程度呈反相变化。 通过pull-down实验,我们证明了任何两个Kai蛋白之间以及KaiA和KaiB自身都能发生相互作用,Kai蛋白间的相互作用通过far-western再次得到了验证,并且发现KaiC与KaiA或KaiB之间的相互作用要强于KaiA与KaiB的相互作用。而SDS-PAGE结果也表明KaiA或KaiB能形成二聚体结构。 以His_6-KaiB为诱饵,通过pull-down首先从铜绿微囊藻7820钓到三个与KaiB相互作用的蛋白,其中一个确定为HSP70-2,其余两个未知。然后,用同样的方法从集胞藻6803中也钓到了HSP70-2,此外还从中筛选到一个与KaiB相互作用的膜蛋白MP。我们推测HSP70-2可能与生物钟的抗热机制有关,通过与KaiB的相互作用实现昼夜节律的温度补偿效应。KaiB可能通过与MP相互作用而锚定在膜上,从而调节它在胞质与膜上的分配比例,最终调控钟蛋白复合物的形成与解聚。