收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

人CuZn-SOD突变基因在聚球藻中的高效表达及活性研究

高淑彬  
【摘要】: 超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)是一种重要的氧自由基清除剂,它催化超氧阴离子自由基(superoxide radical,O2-)的歧化反应。O2-被认为对各种生物大分子及其它细胞组分具有严重的损伤作用,SOD能预防和治疗由超氧阴离子自由基引起的多种疾病如家族性肌萎缩性侧索硬化(FALS)等。在临床上,已用于一些炎症、肿瘤、皮肤病、心血管病等疾病的治疗,用于延缓衰老。在国外,已有含SOD化妆品制剂、抗辐射SOD胶囊、治疗局部缺血症SOD制剂等的专利生产。美国、日本及西欧一些国家早已开发重组人SOD药物,有的已经进入Ⅱ期和Ⅲ期临床研究。因而SOD是一种很有前途的药用酶,作为保健食品及化妆品的有效成分亦有广泛的应用前景,但SOD在体内的稳定性比较差、半衰期比较短,从而使其功能的发挥受到一定的限制。 本研究分别构建人铜锌超氧化物歧化酶(hCuZn-SOD)和突变hCuZn-SOD表达载体并在大肠杆菌中表达,测定两种hCuZn-SOD在不同温度及pH条件下的酶活力。结果表明,两种重组蛋白主要以包涵体形式存在,表达量都占菌体总蛋白的45%以上,突变hCuZn-SOD酶活力高于hCuZn-SOD,且突变hCuZn-SOD稳定性高于hCuZn-SOD,提示从基因突变的角度改善酶的性能的尝试是有益的。然后根据文献提供的序列,设计引物,用PCR技术扩增得到藻蓝蛋白cpc启动子,经过测序,多步克隆,与目的基因hCuZn-SOD、rbcS polyA终止区和Km基因连接,构建为pCMSOD质粒。然后用EcoRI和SalI对蓝藻Synechoccus sp.PCC7942的总染色体进行双酶切,所得的随机片段与经过同样双酶切的表达重组质粒pcMSOD大片段(含cpc启动子、hCuZn-SOD基因、rbcS polyA终止区和Kmr基因)连接,构建成为含有蓝藻染色体DNA同源片段的供体表达质粒。利用自然转化法将该供体质粒转化宿主Synechoccus sp.PCC7942,通过卡那霉素筛选得到具有卡那霉素抗性的转基因藻株。该藻株在BG-11培养基中生长良好,提示随机整合靶位合适。以hCuZn-SOD基因片段两侧序列设计引物对转化藻株的基因组DNA进行PCR扩增并测序,证明目的片段已经整合到宿主的基因组中。转化藻通过光强1200lx诱导后,进行SDS-PAGE,通过凝胶电泳分析发现与预期外源目的基因表达产物hCuZn-SOD大小相当的16KD左右的特异蛋白条带,蛋白扫描结果显示目的蛋白占可溶性蛋白的6.8%,通过Western-blot进一步证实了此特异蛋白的存在。动物实验结果显示转hCuZn-SOD突变基因聚球藻可明显提高小鼠血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力和全血过氧化氢酶(CAT)活性,显著提高小鼠血清和肝脏中CuZn-SOD和总SOD(T-SOD)的活力,显著降低小鼠血清和肝脏的丙二醛(MDA)含量,提示转hCuZn-SOD突变基因聚球藻有较强的抗氧化作用。 本研究首先分别构建hCuZn-SOD和突变hCuZn-SOD表达载体并在大肠杆菌中表达,比较两种表达蛋白的酶活力和稳定性,然后通过随机整合方式将突变的hCuZn-SOD基因整合到蓝藻Synechoccus sp.PCC7942染色体上,动物实验证明转突变hCuZn-SOD基因蓝藻口服后具有较强的抗氧化作用,本研究结果具有一定理论意义和应用价值,为进一步研究开发半衰期长的可直接口服的hCuZn-SOD奠定了基础。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 陈翠丽;郭俊霞;宗伟;施定基;;蓝藻接合转移系统以及相关因素[J];北京联合大学学报(自然科学版);2007年04期
2 韩亚杰;祝建波;董玲;刘辉;陈创夫;;病毒介导的外源蛋白在植物中的表达[J];内蒙古农业科技;2006年02期
3 徐虹,章军;蓝藻生物钟分子机制研究进展[J];海洋科学;2004年07期
4 谢京国;方六荣;肖少波;姚林;潘永飞;陈焕春;;双基因共表达的“自杀性”DNA疫苗载体的改造及其体外表达特性[J];中国兽医学报;2006年06期
5 施庚寿;陈红星;邓继先;;乳蛋白调控元件和乳腺表达载体的研究进展[J];生物技术通讯;2008年05期
6 王淼星;向安;魏大巧;夏雪山;刘丽;;噬藻体光合作用基因研究[J];生物技术通报;2010年01期
7 石国庆;朱汇;万鹏程;代蓉;管峰;;动物生物反应器研究进展[J];南京晓庄学院学报;2011年03期
8 郭祥学,施定基,茹炳根;蓝藻的类金属硫蛋白及其研究进展[J];生物化学与生物物理进展;1996年03期
9 王晓晔;普颖颖;宋杰;王国丰;钱虹妹;林娟;赵凌侠;唐克轩;;利用烟草表达一种新型鲑鱼降钙素的初步研究[J];扬州大学学报(农业与生命科学版);2006年01期
10 赵方庆;梁成伟;秦松;;海洋蓝藻基因组学研究[J];海洋科学;2007年06期
11 徐艳;王琦;梅汝鸿;;蜡样芽胞杆菌M22 Mn-SOD基因的分子改造及在毕赤酵母中的表达[J];农业生物技术学报;2008年05期
12 陈波;王熙;贺新生;张义正;;采用农杆菌介导转化法的泡盛曲霉表达载体的构建[J];食品科学;2009年01期
13 王玉华;黄丛林;贾敬芬;;利用甘薯质体同源片段构建多顺反子表达载体[J];基因组学与应用生物学;2009年04期
14 丁寅寅;马会勤;左芳雷;郝彦玲;陈尚武;;乳酸菌载体pMG36e的应用现状[J];中国生物工程杂志;2009年11期
15 方珊茹;阙友雄;林剑伟;陈如凯;;RS基因的植物表达载体和酵母表达载体构建[J];生物技术通报;2008年03期
16 张晓雯;梁成伟;鲍华燕;秦松;;蓝藻中的主要信号转导系统[J];生命的化学;2009年01期
17 何彰华;王洋;赵珺;刘晓杰;张丽华;王东;师明磊;黄芬;尤平;赵志虎;;一种多基因串联共表达载体的构建[J];中国生物工程杂志;2011年01期
18 王宏伟,金宁一,龚伟,苏忠兰,殷震;温控表达载体的构建及HIV-1p24的表达与纯化[J];武汉大学学报(自然科学版);1999年04期
19 林少苑;李淑彬;;蓝藻生物钟分子机理的研究进展[J];生物化学与生物物理进展;2006年08期
20 宋文贞;夏曦中;郭厚良;;十四属蓝藻液泡的检查和分离[J];氨基酸和生物资源;2006年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 陈芸;廖莎;汪亚平;胡炜;邹均;朱作言;;草鱼出血病病毒RNA干扰的抗病研究[A];遗传学进步与人口健康高峰论坛论文集[C];2007年
2 黄贤华;黄常亮;宋微微;方伟;杨芳炬;;迎春花对脑缺血再灌注损伤小鼠的保护作用[A];第十届全国中药药理学术会议论文集[C];2007年
3 张俊刚;徐颖;陈淑芬;杨卫超;姜红;郭金铭;;葡萄籽提取物复合物对溴代苯油造模小鼠抗氧化作用的研究[A];第四届第二次中国毒理学会食品毒理学专业委员会与营养食品所毒理室联合召开学术会议论文集[C];2008年
4 柏桦;海春旭;;V_E和Cape在体外氧化损伤模型中的协同抗氧化作用[A];第十一次中国生物物理学术大会暨第九届全国会员代表大会摘要集[C];2009年
5 范超君;毕和平;陈湛娟;陈光英;鲍长余;;番木瓜提取物对猪油抗氧化作用的研究[A];海南省药学会二○一○年学术年会会议论文集[C];2010年
6 郭长江;韦京豫;杨继军;葛玉章;;坚果类食物抗氧化作用的研究[A];中国营养学会第五次营养资源与保健食品学术会议论文摘要汇编[C];1999年
7 常红;车素萍;;复方微营康大枣对糖尿病大鼠血糖调节及抗氧化作用的实验研究[A];中国营养学会第八次全国营养学术会议论文摘要汇编[C];2000年
8 谢鸣;袁学勤;张家俊;陈文为;张伟;王雪;;地黄饮子抗氧化作用的实验研究[A];全国中药研究与开发学术研讨会论文摘要集[C];2001年
9 郑建明;陈晓春;张静;郑关毅;林敏;;赤芍801通过抗氧化作用减轻大鼠脑缺血再灌注损伤[A];中华医学会第八次全国老年医学学术会议论文汇编[C];2007年
10 陈彦静;焦宏;杜会博;马建伟;薛贵平;姜华;;桂枝汤对高脂血症大鼠脂代谢和抗氧化作用[A];中国中西医结合学会微循环2009学术大会会议指南及论文摘要[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 黄志立;纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌与毕赤酵母中的表达[D];华南理工大学;2001年
2 刘海岚;两种新的预测水平转移基因的方法[D];浙江大学;2008年
3 张晓雯;蓝藻信号转导系统的比较基因组学分析及重要基因功能的验证[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2008年
4 苏忠亮;一种抗肿瘤蛋白基因在衣藻叶绿体中的重组与表达[D];浙江大学;2005年
5 柴玉荣;杜氏盐藻的RbcS基因及其调控区的克隆和功能鉴定[D];郑州大学;2005年
6 史红艳;柯萨奇病毒B4单、双siRNA表达载体的构建及其抗病毒作用研究[D];吉林大学;2006年
7 杨红玉;人补体C1抑制物基因在真核细胞中表达的研究[D];中国协和医科大学;1995年
8 张艳;HBsAg真核表达载体的构建及在CHO细胞高效表达的研究[D];吉林大学;2008年
9 魏兰珍;外源基因在集胞藻6803中高效表达及调控的研究[D];华东师范大学;2010年
10 李兴暖;地鳖虫纤溶活性蛋白抗血栓、抗肿瘤及其基因克隆与表达的研究[D];汕头大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 高淑彬;人CuZn-SOD突变基因在聚球藻中的高效表达及活性研究[D];厦门大学;2007年
2 徐雪丽;重组人β-防御素-3基因在小鼠乳腺中表达的初步研究[D];河南农业大学;2008年
3 马维民;羊痘病毒结构蛋白P32基因的克隆及其在大肠埃希氏菌中的表达[D];甘肃农业大学;2006年
4 张琳琳;蜡样芽孢杆菌工程菌的构建及α-淀粉酶基因的表达[D];内蒙古农业大学;2007年
5 李洪波;昆虫神经毒素的表达、抗体制备、活性分析及应用研究[D];重庆大学;2008年
6 任道锋;旋毛虫43kDa抗原基因重组质粒pET30a(+)-Ts43的构建与表达[D];郑州大学;2006年
7 魏魏;糖多孢红霉菌表达载体的研究[D];安徽大学;2007年
8 刘博;大肠杆菌稳定期特异性启动子的筛选及pSP表达载体的构建[D];大连理工大学;2007年
9 单连慧;重组CHO细胞高效表达乙肝表面抗原的研究[D];吉林大学;2004年
10 史芳芳;大肠杆菌不耐热肠毒素LT在烟草中的表达[D];石河子大学;2006年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 苗艳丽;今年上半年太湖蓝藻明显减轻[N];中国气象报;2009年
2 记者 蒋寒;湖泊蓝藻污染治理有望[N];科技日报;2009年
3 刘晓东 沈环轩;我省启动太湖蓝藻预警[N];江苏经济报;2009年
4 马薇;无锡全天候监测太湖蓝藻[N];新华日报;2011年
5 ;蓝藻可预防癌症[N];北京科技报;2003年
6 邓华宁;农业专家欲将蓝藻变废为宝[N];中国化工报;2007年
7 王芬兰;2.8亿尾鲢鱼猛吃太湖蓝藻[N];苏州日报;2007年
8 黄杰;蓝藻肆虐带来新商机[N];中国经营报;2007年
9 燕志华;太湖蓝藻今年“迟到”一个月[N];新华日报;2010年
10 曹旭超;省领导检查太湖蓝藻应急防控[N];新华日报;2011年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978