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南极中度嗜盐菌盐单胞菌Nj223四氢嘧啶生物合成基因ectABC的克隆及其功能初步研究

陈志亮  
【摘要】: 南极普里兹湾特定的地理环境和海底地形特点,能够长久保持高盐、低温、高海水密度等特点,其海底沉积物的微生物往往具有适应特殊环境的生理学上的特异性。其特定的生态环境蕴藏着独特而又极其丰富的微生物资源,其中大部分还鲜为人知,这为研究中度嗜盐菌盐适应机制开辟了一个崭新的平台。 对普里兹湾深海沉积物中筛选到的中度嗜盐菌盐单胞菌Nj223(Halomonas sp. Nj223)进行分类鉴定并分析其主要累积的相容性溶质种类及浓度。Nj223主要累积相容性溶质为四氢嘧啶(ectoine),其次是谷氨酸(Glutamate)。根据四氢嘧啶合成基因ectABC的蛋白氨基酸的保守序列,设计了多对引物,以该菌株基因组DNA为模板进行PCR扩增后,经过序列测定和Blast分析,确定其为ectABC基因的部分序列。经过多次PCR和反向PCR,最终获得了一个全长2826bp的DNA片段。初步分析该片段含有编码四氢嘧啶生物合成途径中的三个酶的基因,ectA、ectB、ectC及上下游序列。 为了研究该基因簇的功能,构建含ectABC编码基因的重组质粒pET-28a(+)-ectABC,转化E.coli BL21(DE3)后得重组子pKS002,提取质粒,酶切,测序结果表明pKS002中重组质粒确实含有ectABC编码基因。观察到该重组子pKS002在基本培养基M63中耐盐能力得到提高。进一步分析,提取该重组子细胞内的相容性溶质,HPLC分离纯化后13C NMR检测到四氢嘧啶的波峰,说明了该菌株是由于合成了四氢嘧啶提高了其耐盐能力。 对ectA、ectB、ectC进行克隆及诱导表达,分离纯化后得到四氢嘧啶生物合成途径中的三个重组蛋白酶,EctA,EctB和EctC。分别加入各自底物,测定酶活力来验证其反应方程式,从而在体外验证了该菌株四氢嘧啶生物合成途径。分析这三个重组蛋白酶发现,具有相似的酶学性质。 四氢嘧啶在保护生物大分子上具有独特的功效,因此,我们研究了Nj223菌株分泌的四氢嘧啶对乳酸脱氢酶的保护作用,实验发现,四氢嘧啶能够明显增强乳酸脱氢酶的抗热、盐酸胍、冻干、冻融等不利因素的能力。实验还发现,四氢嘧啶具有使感受态细胞反复冻存后仍具有较高转化效率的能力。


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