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基于红树林土壤微生物资源研发的宏基因组学平台技术的建立与应用初探

蒋云霞  
【摘要】: 红树林土壤处于“海洋-陆地”界面潮间带环境,其生境的独特性决定了其中微生物的多样性及基因资源的珍稀性,深入开展红树林土壤微生物的研究将加快新型功能基因、新颖天然产物的发现进程。完全不依赖于平板分离的现代宏基因组学技术为充分探索不同自然生境中的微生物资源提供了有力手段。然而,将该技术实施于红树林土壤微生物的研究时,尚存在若干困难:①红树林土壤为高粘质、高有机质含量类型土壤,提取DNA时存在大量腐殖酸及腐殖酸类等高分子量抑制性物质的共提取等问题,造成所得DNA品质低下,难于进行微生物多样性分析。②DNA提取过程中,红树林土壤中高含量的粘质极易吸附刚从微生物细胞裂解释放的大片段DNA,造成所得DNA提取物中大片段DNA所占比率低下,难以构建大片段宏基因组文库应用于特色微生物资源的“生物探矿”。针对上述难点,本论文系统开展了红树林土壤DNA提取缓冲液的改良与应用研究;红树林土壤大片段宏基因组文库构建方法的改良与应用研究;并针对现行环境宏基因组学技术所存在的“群落结构偏差”和“基因遗漏”等瓶颈,开展了不同裂解方式对红树林土壤不同类型土著微生物细胞裂解能力的研究;获得了如下主要研究结果与结论: 1.提取土壤DNA时,缓冲液中的NaCl是决定抑制性物质共提取量高低的关键因素之一,随NaCl浓度的升高,腐殖酸等抑制性物质的共提取量明显下降,而Na_3PO_4对抑制性物质共提取量的影响却呈现完全相反的规律;PVP在土壤微生物细胞裂解前及裂解过程中使用均增加抑制性物质的共提取量,裂解后使用反而能提高DNA提取物的品质;PVPP在土壤微生物细胞裂解前及裂解过程中使用均减少抑制性物质的共提取量,裂解后使用反而无效;CTAB在土壤微生物细胞裂解前、裂解过程中及裂解后使用均能提高DNA初提物的品质;随缓冲液中SDS浓度的升高和裂解时间的延长,抑制性物质的共提取量明显增加:随缓冲液中CTAB浓度的升高,抑制性物质的共提取量逐渐减少,随裂解时间的延长,抑制性物质的共提取量表现为先增加后减少的规律;CTAB在缓冲液中使用具有裂解微生物细胞和去除抑制性物质的双重作用,去除抑制性物质的作用占主导地位;PVP、PVPP及CTAB在不同浓度及不同作用方式下使用均不改变环境样品的细菌群落结构;提取缓冲液含1.5mol.L~(-1)NaCl,2%CTAB及2%PVPP时,所得红树林土壤DNA初提物不经纯化即可成功进行PCR扩增反应。 2.运用本研究改良后的原位裂解提取法能有效提高大片段DNA在总土壤DNA中的比率,该方法与电洗脱纯化法联用能高效构建红树林土壤大片段宏基因组文库。本论文所得4个季节红树林土壤宏基因组文库,含9570个cosmid克隆子,每个克隆子的平均插入片段均大于35kbp。运用功能筛选方法,从该文库中得到1株具有四环素抗性的克隆子,1株产褐色色素的克隆子和1株具有淀粉酶活性的克隆子。 3.通过古生菌、细菌、真菌及放线细菌特异性引物对不同裂解方法所得红树林土壤DNA进行PCR反应,结果表明:SDS、溶菌酶、液氮冻融、玻璃珠剧烈振荡、超声波、微波等6种常规裂解方式单独应用均能裂解红树林土壤土著细菌和古生菌,均不能裂解红树林土壤土著放线细菌和真菌;SDS、溶菌酶及玻璃珠剧烈振荡等3种方法联用时能裂解红树林土壤土著真菌;SDS、溶菌酶、玻璃珠剧烈振荡及微波等4种方法联用时能裂解红树林土壤土著放线细菌。 4.运用DGGE方法比较上述6种裂解方式捕捉红树林土壤土著细菌群落结构信息的能力,结果显示:没有1种裂解方式能获得完整的细菌群落结构信息;超声波、微波裂解法所得红树林土壤细菌群落结构与溶菌酶裂解法所得结果相似;其它4种裂解法所得红树林土壤细菌群落结构各不相同,每种裂解方法均含有其它方法所遗漏的物种信息。 5.红树林土壤微生物胞外DNA包含细菌和古生菌的基因组信息,不包含放线细菌及真菌的基因组信息;同种红树植物-白骨壤根际土壤细菌群落受土壤深度及季节变化因素影响小。 红树林土壤微生物宏基因组学研究平台技术的建立,不仅为潮间带特色微生物的生态学基础研究、生物技术应用研究提供了有力的技术保障,而且为其它生境宏基因组学领域的研究提供了有益借鉴。


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