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蓝猪耳精、卵细胞,中央细胞,助细胞以及原胚细胞的分离

杨延红  
【摘要】: 高等植物的雌性配子细胞深藏在子房内的胚珠体细胞组织中,形成了对高等植物受精机理研究的障碍。而将高等植物的精、卵细胞和其他雌配子体细胞分离出来,在体外诱导精、卵细胞的融合以及对人工合子和其他分离得到的雌配子细胞体外进行细胞学和分子生物学的研究可克服这种障碍,达到研究高等植物受精机理的目的。分离的雌、雄配子、合子以及早期胚细胞结合分子生物学方法研究这些细胞的结构和功能已成为一个新的研究领域。蓝猪耳(Toreniafournieri)具有胚囊半裸露的特点,近几年来逐渐成为研究植物受精生物学的一种模式植物。在我们的实验中,我们分离了一定数量具有生活力的精、卵细胞、中央细胞、助细胞、以及二胞原胚中的顶细胞与基细胞。 1.蓝猪耳精细胞分离:蓝猪耳成熟花粉是二胞型。我们采用活体-离体技术培养了蓝猪耳的花柱使其长出花粉管,然后用渗透压冲击法促使花粉管尖端破裂,释放出一对与营养核相连的精细胞。通过对45对精细胞直径大小进行单因素方差分析发现,蓝猪耳的一对精细胞在体积上呈显著差异,具有二型性。并首次发现,爆破出的两个精细胞的生活力也是有所差异的,经FDA染色时发现,和营养核相连大的精细胞(Svn)的荧光明显弱于小的精细胞(Sua)。对大小两个精细胞进行了群体的收集。 2.蓝猪耳卵细胞和合子分离:在准确掌握了蓝猪耳胚囊发育的时期和授粉至受精时间的基础上,分离出大量生活状态良好的卵细胞与合子;观察了体内卵细胞与助细胞受精前后的一些细胞学变化;对于体内合子从受精起始到分裂为二胞原胚的一系列变化也进行了观察。同讨还发现花粉管进入胚囊后,在蓝猪耳胚珠内部形成了一条淀粉粒带,而在受精前的胚珠中完全不存在这条淀粉粒条带,这是由受精引起的雌性器官内部营养物质的变化。我们首次对高等植物分离后的卵细胞与合子进行电泳,发现卵细胞与合子表面都带正电荷。在电场作用下,细胞的移动速度主要取决于其表面电荷的多少。在实验中,合子的移动速度比卵细胞快,暗示受精后,合子所带的表面电荷增加。卵细胞与合子的大量分离为高等植物受精机理的研究创造了条件。 3.蓝猪耳中央细胞和助细胞分离:在对以上分离技术不断完善和改进的基础上,我们分离出了受精前后的中央细胞以及不同时期的助细胞。结果发现,受精前后的中央细胞在体积与细胞状态均有很大差异,受精前的中央细胞体积较小,含有很多大液泡,且细胞内部的淀粉粒较少;而受精后的中央细胞体积变大,液泡减少,细胞内部充满了淀粉粒。通过比较不同发育时期的助细胞,发现两个助细胞只是在体积上略有差异,而在细胞状态上看不出任何差异。 4.蓝猪耳二胞原胚的顶细胞和基细胞分离:随着对高等植物受精机理以及胚胎发生研究的不断深入,近几年来,高等植物早期的胚胎发生机制引起了一些学者很大的兴趣。顶细胞和基细胞的分化机制是一个非常有吸引力的研究领域,但目前还很少报道。因而,我们首次分离了蓝猪耳二胞原胚的顶细胞和基细胞,并收集到一定数量,为将来开展比较合子与二胞原胚的分子生物学研究打下了基础。


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