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磷酰化氨基酸和磷酰化蛋白的荧光探针法初探

杨俊华  
【摘要】: 蛋白质中特定位点氨基酸的磷酰化和去磷酰化在生物体系中扮演着十分重要的角色。通常,蛋白质磷酰化和去磷酰化过程类似于一个分子开关,调节着生命活动的整个过程,包括细胞的增殖、发育和分化,神经活动,信号转导,肌肉收缩,新陈代谢,肿瘤发生等。真核生物细胞蛋白质中最常见的磷酰化类型是丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸酯化,也是目前的研究热点之一。同时,在氨基酸的存在下检测磷酰化氨基酸对于了解很多蛋白的角色起着十分重要的作用。本论文将Tb~(3+)-TR络合物荧光探针运用于研究磷酰化氨基酸和磷酰化蛋白,研究工作共分为四章。 第一章综述了磷酰化氨基酸和磷酰化蛋白研究的主要进展,包括磷酰化氨基酸和磷酰化蛋白的检测、识别、定量研究等。同时对稀土络合物荧光探针的原理及其应用进行了评述。并在相关研究进展和本实验室前期研究成果的基础上提出了本论文的研究设想。 第二章在本实验室前期运用Tb~(3+)-TR络合物荧光探针研究含磷酸基团的核苷酸、聚核苷酸、核酸、卵磷脂、辅酶、结合蛋白酶等化合物的基础上,进一步探讨将该探针用于研究磷酰化氨基酸的可能性,并初步探讨了相关含磷酸基团化合物与Tb~(3+)-TR络合物荧光探针的作用机理,同时初步尝试将该探针技术运用于指示磷酰化氨基酸水解和去磷酰化过程的可能性。 第三章在第二章的研究基础上利用Tb~(3+)-TR络合物荧光探针监测了磷酰化丝氨酸(P-Ser)、磷酰化苏氨酸(P-Thr)和磷酰化酪氨酸(P-Tyr)在一定条件下的完全水解,并根据磷酰化氨基酸水解产生的无机磷酸盐猝灭Tb~(3+)-TR络合物荧光探针的荧光这一现象,建立了三种磷酰化氨基酸的高灵敏分析测定方法。测定磷酰化丝氨酸、磷酰化苏氨酸和磷酰化酪氨酸的线性范围分别为:5.0×10-8 ~5.0×10-7 mol/L,5.0×10-8 ~6.0×10-7 mol/L和5.0×10-8 ~6.0×10-7 mol/L,检测限分别为:2.1×10-8mol/L,1.1×10-8mol/L和1.7×10-9mol/L。最后尝试用酶促反应水解磷酰化酪氨酸并利用Tb~(3+)-TR络合物荧光探针进行测定,测定的线性范围为:5.0×10-8~8.0×10-7 mol/L,检测限为3.8×10-8 mol/L。 第四章在前一章测定磷酰化氨基酸的基础上,继续开展磷酰化蛋白中磷酰基含量的测定研究。选取卵黄高磷蛋白为考察对象,对其进行磷酰基含量的测定研究。得卵黄高磷蛋白中的含磷量为8.94%(w/w),而卵黄高磷蛋白的标识磷含量为8~10%(w/w),结果一致。并进一步计算得出其123个丝氨酸残基中有98个为磷酰化丝氨酸,该结果为进一步深入研究磷酰化蛋白提供了有利的参考数据。


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