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红树林湿地微生物对典型有机物污染的响应及其在生物修复中的作用研究

刘慧杰  
【摘要】: 以福建龙海浮宫九龙江口红树林为研究区域,设置四个断面16个采样站位,于冬季和夏季采集红树林表层沉积物样品。对16个站位的理化因子、胞外酶活性、微生物数量分布特征以及PAHs污染胁迫下红树林沉积物微生物群落响应等方面进行了研究。同时,从红树林沉积物中分离得到了多株PAHs降解菌,采用PCR-DGGE技术分析了PAHs降解单菌的不同组合对单一和混合PAHs的降解规律。主要的研究结果如下: 1、分别测定了冬季和夏季16个站位红树林表层沉积物的pH值、盐度、温度、有机碳(TOC)、有机质(TOM)、油类含量等理化参数,同时,应用荧光模拟底物的方法和GC/MS的方法对红树林沉积物中的胞外酶活性和PAHs含量也进行了测定,并分析了这些环境参数的相关关系。结果表明,冬季与夏季各环境参数之间有显著差异;各站位α-葡萄糖苷酶活性(α-GlcA)的变化范围分别为10.63μmol/gh-100.86μmol/gh和43.80μmol/gh-197.78μmol/gh;β-葡萄糖苷酶活性(β-GlcA)的变化范围分别为39.60μmol/gh-222.75μmol/gh和169.88μmol/gh-676.93μmol/gh,各站位α-GlcA与β-GlcA呈显著相关性(R~2=0.8215和R~2=0.7582),且β-GlcA显著高于α-GlcA (p0.05):α-GlcA和β-GlcA与各站位TOC、TOM呈显著相关性,与其它理、化参数无相关关系:不同站位的PAHs含量范围为279.98 ng/g-1074.50 ng/g,各站位均表现为高分子量的PAHs组分占优势,该区域PAHs主要来源于矿物如柴油、汽油和煤的不完全燃烧。 2、对两个季节红树林沉积物各站位异养细菌、菲(Phe)、芘(Pyr)、荧葸(Flu)、苯并芘(Bap)和混合PAHs(M-PAHs)降解菌进行了计数,分析了它们与各环境参数的相关关系。结果表明,夏季的异养细菌、Phe降解菌、Pyr降解菌、Flu降解菌、Bap降解菌及M-PAHs降解菌数量明显高于冬季;不同季节异养细菌数与各环境因子有不同程度的相关性,同一季节异养细菌数与α-GlcA和β-GlcA均呈显著正相关;各站位不同PAHs降解菌的数量与相应PAHs的含量无显著相关性。 应用PCR-DGGE技术对红树林沉积物各站位的微生物群落结构进行了分析。结果表明,每个站位都存在着在丰富的微生物多样性,夏季各站位的细菌种类数多于冬季,红树林区细菌多样性高于非红树林区细菌多样性;各站位细菌多样性指数、丰度和均匀度均有不同,不同站位的相似性系数变化较大;聚类分析表明同一断面相邻站位相似性系数较高分类位置较近。 应用16S rDNA文库技术对红树林沉积物各站位的微生物多样性也进行了分析。结果表明,绝大多数序列对应的细菌均为未培养微生物,这些微生物中变形菌门(Proteobacteria)占优势(70.0%),其次还有拟杆菌门(Bacteroidetes)占8.0%,浮霉菌门(Planctomycetacia)、放线菌门(Actinobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)分别占2.0%,除此之外,还检测到未可培养,性质以及分类尚不清楚的细菌占16.0%。无论是PCR-DGGE还是16S rDNA文库的方法,结果均表明红树林沉积物存在着丰富的微生物多样性。 3、通过PCR-DGGE技术研究红树林沉积物微生物在PAHs污染胁迫下的群落结构变化。结果表明,当加入不同浓度的Phe、Pyr、Bap、M-PAHs后,在不同的时间,微生物群落结构发生了不同的变化。不同浓度的PAHs对红树林沉积物中的微生物群落结构的影响不同,较高浓度的PAHs对微生物群落结构的影响也较大,同时在高浓度的PAHs胁迫下,微生物群落结构发生改变的响应时间也较短。发生明显变化的DGGE条带序列所代表的微生物大部分为未培养微生物。 4、从红树林冬季沉积物样品中分离得到14株PAHs降解菌,它们都属于变形菌门(Protcobactcria),其中7个属于α-proteobacteria,占50%,7个属于γ-proteobacteria,占50%。对夏季样品以选用不同培养基为筛选策略,经细菌形态分类和RFLP分型后,分离得到67株PAHs降解菌。两个季节共得到不同的PAHs降解菌56株,变形菌门(Proteobacteria)38株,占67.8%,包括α-proteobacteria为14株,β-proteobacteria为1株,γ-proteobacteria为23株;拟杆菌门(Bacteroidetes)5株,占8.9%,包括鞘脂杆菌纲(Sphingobactcria)2株,黄杆菌纲(Flavobacteria)3株;放线菌门(Actinobacteria)5株,占8.9%;厚壁菌门(Firmicutes)的芽孢杆菌纲(Bacilli)8株,占14.3%。 5、利用平板升华法观察降解菌对PAHs利用能力,结果发现Phe降解菌F2在MM2平板和2216E平板均形成明显的透明圈,同时发现不同降解菌利用PAHs做为碳源进行生长的情况不同。另外,以不同PAHs降解菌驯化过程中DGGE条带的变化信息为依据,将优势条带对应的降解单菌进行组合,研究混合菌系对不同PAHs的降解效果,结果表明,Phe降解菌系和M-PAHs降解菌系对Phe均有较高的降解率,这些降解菌系对三环PAHs的降解率要高于四环和五环PAHs的降解率。


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