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大肠埃希氏菌K-12糖代谢的外膜蛋白质组学研究

张洪华  
【摘要】: 大肠埃希氏菌是寄生于人或其他哺乳动物肠道内的细菌,属肠细菌科(Enterobacteriaceas),革兰氏阴性,为需氧或兼性厌氧菌,由于它取材广泛,分裂增殖能力强、发育周期短以及结构简单等特点,已作为一种重要的模式生物在近现代生命科学研究尤其在分子遗传学及生物工程领域起着异常重要的作用。本文运用蛋白质组学特别是功能蛋白质组学的方法对大肠杆菌K-12的外膜蛋白进行了研究,对其进行分离和鉴定,在此基础上分析了大肠埃希氏菌在葡萄糖代谢过程中外膜蛋白的表达变化。 首先,采用月桂酰肌氨酸钠的方法提取了大肠埃希氏菌K-12的外膜蛋白,对其进行了2-DE,并通过质谱分析鉴定了其中16个差异蛋白,包括了12种外膜蛋白,为下一步的研究奠定了基础。 然后,根据实际情况对2-DE的10个差异蛋白进行了Western blot验证,结果显示,在3个葡萄糖梯度条件下,Fhue、TolC、OmpA、OmpW、Dps、FadL和OmpC的表达量均明显地随着葡萄糖梯度的提高而逐渐顺次提高;Ef-Tu、OmpF和OmpT的表达量则随着葡萄糖梯度的提高而逐渐顺次降低。这些结果均与2-DE的分析结果一致,表明这10种蛋白(除了Dps外均为外膜蛋白)在E.coliK-12的糖代谢过程中,分别具有一定的作用。 最后,在对这些结果进行Western blotting证实的基础上,采用基因敲除菌株和补救菌株进一步进行葡萄糖代谢分析。结果表明,OmpA有助于提高大肠埃希氏菌外膜对葡萄糖进入的通透性,而TolC、OmpW、OmpC和OmpF降低了外膜的通透性,排斥葡萄糖进入细胞。除了Dps还未知外,FadL,OmpT均为已知的孔蛋白,它们的表达不论上调还是下调,均降低了外膜的通透性。进一步实验显示,大肠埃希氏菌K-12的葡萄糖代谢还受EnvZ/OmpR双成分调节系统的调节。这些结果均显示外膜蛋白在革兰氏阴性细菌的葡萄糖代谢中起到了重要作用。


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