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一个拟植物转录因子家族的初步研究

王宏刚  
【摘要】: 转录因子(transcription factor,TF)是一类可以同真核生物启动子特定DNA序列结合的蛋白质分子,在高等植物的生长发育及其对外界环境的反应中起着重要的调控作用。我们对一个通过生物信息学分析推断为新的植物转录因子的基因家族进行了初步的研究,具体情况如下: (1)通过生物信息学的数据库以及相关软件,对我们所研究的转录因子家族进行了生物信息学的分析。通过多序列联配发现该转录因子家族基因成员包括两个保守区;同时进行系统发生分析将这些成员划分为4个亚族;利用EST数据库对这些基因的表达信息进行检索,发现该家族中的大部分拟南芥基因在花、种子中表达,大部分水稻基因在花、芽和愈伤组织中表达;二级结构预测表明,这些蛋白含有锌指结构、低复杂度区域、DUF1644,环指结构四类结构域,表明该家族成员可能具有转录因子的功能。 (2)以拟南芥基因组DNA为实验材料克隆基因At1g15430,At5g38370,以水稻基因组DNA为实验材料克隆基因0s09g27860,0s01g42700,0s02g35840,然后构建其pGEX-4T-2原核表达载体,转入表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta~(TM)进行原核表达,目的蛋白主要以包涵体的形式存在。最佳诱导条件为:诱导时菌体密度OD_(600)约为0.6,诱导物IPTG浓度1.0mmol/L,诱导温度28.5℃,诱导时间4h。并利用GST Resin分离得到了少量的GST-At1g15430可溶性融合蛋白。 (3)利用搭桥PCR的办法克隆嵌合基因At1g15430-GFP、At5g38370-GFP、0s01g42700-GFP、0s09g27860-GFP,并将嵌合基因片段连接到克隆载体pMD18-T。经测序后,利用限制性内切酶将其从pMD18-T上切下,构建表达载体pBPF。通过基因枪转化法,将其转入洋葱内表皮细胞进行亚细胞定位的研究。通过Bio-RadMRC1024共聚焦激光扫描显微镜观察,转0s01g42700-GFP的洋葱内表皮细胞在细胞核和细胞质中均绿色荧光,转At5g38370-GFP的洋葱内表皮细胞在细胞核中有绿色荧光,转At1g15430-GFP的洋葱内表皮细胞在细胞质中有绿色荧光,转0s09g27860-GFP的的洋葱内表皮细胞没有观察到绿色荧光。这个结果表明,0s01g42700一GFP基因的表达产物部分被转运入核,At5g38370-GFP基因的表达产物全部转运入核,At1g15430-GFP基因的表达产物没有转运入核,0s09g27860-GFP基因没有表达。


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