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红树植物耐盐基因的克隆与分析

李芳  
【摘要】: 植物受盐碱和水分胁迫时,细胞质中积累大量有机渗透调节剂,如甘露醇、海藻糖、甜菜碱和脯氨酸等,而将细胞质中的无机渗透调节剂(主要是K~+)挤向液泡,使胞质与细胞(液泡)外环境维持渗透平衡,这样就避免了细胞质高浓度无机离子对酶和代谢的毒害。除维持细胞的正常膨压外,甜菜碱还具有无毒渗透保护剂的作用,能够稳定复杂蛋白质高级结构,从而使得许多代谢过程中的重要酶类在渗透胁迫下继续保持活性。 甜菜碱是以胆碱为底物经两步酶催化氧化生成,催化第二步反应的是甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase,BADH)。甜菜碱脱氢酶是一个限速酶,甜菜碱的增加与它的活性有关,因此BADH基因的有效表达可增强植物的耐盐性。自1981年从高等植物中首次分离得到BADH基因后,对BADH基因的研究报告陆续有报道。目前,已经先后从大肠杆菌、酵母以及多种高等植物中克隆到BADH基因的cDNA。据推测,单子叶植物的BADH基因可能位于微体中,而双子叶植物BADH基因位于叶绿体中。 本文对红树植物BADH基因的克隆与分析进行了初步的探索,主要结果如下: 1、采用CTAB法提取白骨壤总RNA,经1.0%琼脂糖凝胶电泳和OD_(260)与OD_(280)的检测,结果显示,28S rRNA条带亮度是18S rRNA条带亮度2倍以上,而且OD_(260)/OD_(280)值非常接近2.0,表明我们提取的白骨壤总RNA完整性较好,基本上没有发生降解;纯度较高,所含杂质很少,可用于后续实验中RT-PCR的进行。 2、以提取的白骨壤总RNA为模板,用反转录酶反转录生成cDNA,利用简并引物,通过递减PCR(Touch down PCR)技术扩增出约250bp的BADH基因核心片段。经过比对,它和已报道的白骨壤BADH基因同源性高达80%。 3、根据扩增得到的白骨壤BADH基因片段设计引物,分别进行3’RACE和5’RACE,扩增白骨壤BADH基因未知的3’端和5’端,并分别得到约350bp(3’RACE)和1.0kb(5’RACE)的特异性片段。测序和比对后,证实我们成功地扩增到了白骨壤BADH基因的3’端和5’端。 4、在以上实验基础上,重新设计白骨壤BADH基因特异性引物,从白骨壤总RNA反转录生成的cDNA中扩增得到一条约1.5kb的特异性条带。经过测序和比对后,进一步确定成功克隆到白骨壤的BADH基因。BADH基因编码区全长1509bp,编码502个氨基酸。对BADH基因的分析发现,它与已报道的白骨壤BADH基因的同源性均在90%以上。 5、用T4连接酶将pGBKT7和BADH基因连接起来,转入酵母AH109中,在含NaCl梯度浓度的SD-Trp培养基中生长,通过测量生长曲线发现,重组酵母AH109(pGBKT7-BADH)对NaCl的耐受度由原有的9%提高到14%,表明从白骨壤中扩增得到的BADH基因在酵母AH109中能有效转录并翻译出蛋白质,具有生物学活性。


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