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深海细菌Geobacillus stearothermophilus TH10中嗜热脂肪酶的表达鉴定及体外诱变研究

杨欣  
【摘要】: 高温酶因理论研究和工业应用上的双重意义受到越来越广泛的关注。研究高温酶的适应机制不仅有助于解释生命起源问题,而且对于工业用酶的开发有理论指导作用。 深海热液口作为极端环境的一种,具有高温高压高还原物质等特征,这也意味着其中蕴含着丰富独特的微生物资源。它的开发对于高温酶的研究具有重要意义。在生物催化剂的研究和应用中,微生物脂肪酶一直占据着非常重要的地位。高温脂肪酶因热稳定性好,可以省略一些工业步骤从而大大节约制造成本,已广泛应用于食品、化妆品、皮革、饲料、废物处理等领域。 我们从深海热液硫化物样品4143-1分离筛选到一株高产脂肪酶菌株TH10,其最适生长温度65℃,16s rRNA鉴定其为Geobacillus。 用Geobacillus脂肪酶保守序列设计引物,成功扩增得到TH10脂肪酶基因全长,克隆后于E.coli中重组表达,性质检测结果显示其为高温酶,最适酶活为80℃,即使在90℃仍然保持70%以上的活性。TH10脂肪酶偏碱性,在PH8.0-9.0都有较高活性。在耐受金属离子方面,该酶并没有较大的优势,所有的金属离子都不同程度的对酶活性起抑制作用。而在去污剂和酶抑制剂存在的条件下,TH10表现极大的耐受性,tween20和chaps对酶活性都有一定的提高作用。 Geobacillus TH10脂肪酶的三维模拟结构显示,它具有脂肪酶共同的α/β三层结构,另外,存在一个由2个片状结构和2个α螺旋组成的特殊结构区,是Geobacillus脂肪酶较保守的区域。温度较低时,该结构区覆盖在催化区起保护作用。 TH10脂肪酶在用PNP底物检测时表现仅对降解短链脂肪酸链有优势,以C2和C4为最适。通过和同源性最近的Staphylococcus比对,构建了三个突变子,Q142M,I347V,Q142M/I347V,通过对突变蛋白与野生型蛋白性质比较发现其对底物PNP-C2的活性增强,突变子I347V和Q142M/I347V的热稳定性有不同程度的提高。 目前,关于Geobacillus脂肪酶的结构研究还不多,而定点突变技术需要建立在对目的蛋白的清楚认识和理性分析基础上。另外,定点突变改变的氨基酸数量有限,而蛋白任一性质都取决于多个氨基酸的相互作用。我们也尝试用易错PCR对TH10脂肪酶进行体外定向进化。初步结果表明,5mM的MgCl_2可以控制易错PCR的错配率在合适的范围,从降解PNP-C10的能力来看,文库可能包含有益突变。这一结果有待验证,相关的工作还在进行中。 我们从深海热液硫化物样品筛选到高产脂肪酶菌株Geobacillus TH10。对其脂肪酶进行克隆表达,测定了系列酶学性质。Geobacillus TH10脂肪酶相比其他已报道的Geobacillus属来源的脂肪酶有更高的热稳定性,是进一步研究嗜热脂肪酶的高温适应机制和稳定性较好的材料。利用定点突变技术研究了在该嗜热脂肪酶底物特异性和热稳定性方面起关键作用的氨基酸,并试图通过定向进化的方法找到能在降解长链脂肪酸方面有优势的突变子。已有的研究将为后期酶学性质完善提供理论指导依据。


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1 杨欣;深海细菌Geobacillus stearothermophilus TH10中嗜热脂肪酶的表达鉴定及体外诱变研究[D];厦门大学;2009年
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