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大黄鱼免疫应答的功能蛋白质组学研究

余素红  
【摘要】: 大黄鱼(Pseudosciana crocea)是我国特有的经济鱼种,但随着养殖规模的扩大及养殖环境的恶化,病害问题日益严重,已成为制约大黄鱼养殖业持续稳定发展的主要因素。因此,开展大黄鱼免疫的分子基础研究,揭示其免疫反应规律及免疫的分子机制,不仅可以深化对以鱼类为代表的低等脊椎动物免疫系统的认识,也为大黄鱼病害防治提供重要的理论依据。 本文首先采用双向电泳分析了Poly(I:C)诱导不同时段大黄鱼脾脏组织差异表达的蛋白,结合PMF和MALDI-TOF-TOF质谱技术共鉴定了38个差异点,其中28个差异点表达上调,10个表达下调,且表达变化多集中于诱导后12h-24h之间。为了了解各差异点间的相互关系以及它们在抗病机制中的作用,通过应用Cytoscape软件构建了差异蛋白互作网络图,发现其中有许多差异点如PPRAγ、AnnexinⅣ、ROCK1等同时参与了免疫调节与凋亡调节,尤其是AnnexinⅣ表现出多功能的特性。为了研究大黄鱼AnnexinⅣ的功能,采用重组AnnexinⅣ注射大黄鱼,结果发现AnnexinⅣ的活体过表达能明显提高Caspase 3的酶活力,并促进脾脏细胞的凋亡。同时,它能抑制趋化因子CXC、CC的表达和上调抑炎因子IL-10的表达,表明了大黄鱼AnnexinⅣ具有促进细胞凋亡和调节炎性反应的功能。在PolyI:C诱导后12h,AnnnxinⅣ的上调可能在一定程度上促进了脾脏细胞凋亡并抑制了炎性反应,而诱导后48h,凋亡抑制因子PRDX I、AIP的表达上调则有利于凋亡的抑制,从而调节PolyI:C诱导的免疫反应及维持免疫平衡。 通过比较对照组和三联疫苗注射组的双向电泳图谱,找到了24个差异点,其中21个表达上调,3个表达下调。质谱分析鉴定发现其中有许多与免疫应答及炎症调节相关,尤其抗氧化蛋白酶家族成员如PRDXⅠ、PRDXⅡ、PRDXⅣ在三联疫苗诱导前后表达量都发生了改变,提示该家族可能在三联疫苗诱导免疫反应中发挥重要的作用。研究表明,人PRDXⅣ能通过调节IκB的磷酸化来激活核因子NF-κB,但对其功能尚不清楚。为此,本文对大黄鱼PRDXⅣ的分子特征及功能进行了研究:体外实验表明重组的大黄鱼PRDXⅣ具有明显的抗氧化活性;免疫电镜分析发现PRDXⅣ主要分布于脾脏细胞内质网和过氧化物酶体中,并且三联疫苗的免疫刺激促进了PRDXⅣ在内质网上的合成;针对PRDXⅣ的siRNA干扰可上调脾组织TNF-α2、CC趋化因子的表达水平,下调抑炎因子IL-10的表达,同时核因子NF-κB(p65)的表达水平也明显上升;PRDXⅣ的过表达则抑制了TNF-α2、CC趋化因子的表达,上调了IL-10的表达,核因子NF-κB(p65)的表达也受到明显的抑制,说明了大黄鱼PRDXⅣ具有抑制炎性反应的功能。以三种混合活菌感染大黄鱼,发现干扰组脾脏组织TNF-α2、CC及NF-κB(p65)的表达上调更加显著,抑炎因子IL-10的表达明显低于对照组,同时干扰组大黄鱼的死亡率(94%)明显高于过表达组(42%)和对照组(72%、78%),这些结果表明了大黄鱼PRDXⅣ可能通过抑制NF-κB表达发挥其抗炎作用,从而保护大黄鱼抵抗细菌的感染。本文研究结果揭示了一条鱼类抗细菌感染的新途径。 此外,还分析了差异表达蛋白NCCRP-1和β_2-microglobulin mRNA的组织分布及不同诱导条件下的表达调控方式,这些将有助于对大黄鱼免疫反应规律的全面认识。


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