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腺病毒DDEFL1 shRNA干涉载体的构建以及DDEFL1生物学功能的初步探讨

孔芳  
【摘要】: DDEFL1又名UPLC1、ACAP4、ASAP3,是ARF-GAP家族的一个新发现的成员。与该家族的大部分成员一样,该蛋白具有BAR、PH、GAP和ANK等多个结构域,可能在细胞内囊泡运输、细胞骨架组装、细胞生长、细胞迁移等方面发挥着重要的作用,并有可能为低营养以及低氧分压下的细胞生长提供有利条件。研究表明,DDEFL1在一些人肝细胞癌中超量表达,而且利用反义S-寡聚核苷酸抑制DDEFL1的表达可显著抑制SNU423肝肿瘤细胞的生长。在宫颈癌HeLa细胞和乳腺癌MDA-MB-231细胞中,siRNA介导的DDEFL1敲降显著降低了细胞的迁移能力。人的肝和肺是DDEFL1表达水平较高的两个组织。 在本研究中,我们设计并化学合成了三对DDEFL1-shRNA用于构建真核表达载体pSilencer-DDEFL1-shRNA,然后PCR扩增出含有H1 promoter+DDEFL1-shRNA的RNAi表达框,并将表达框分别插入pAd-Track,然后通过同源重组的方式得到腺病毒载体pAd-DDEFL1-shRNA,最后经过AD293细胞包装,得到携带DDEFL1-shRNA的重组腺病毒Ad1、Ad2、Ad3和携带一段随机序列的阴性对照腺病毒Ad4。我们利用这些重组腺病毒感染细胞后,采用半定量RT-PCR和Western印迹分别检测DDEFL1 mRNA和蛋白表达水平。最后,我们还利用划痕损伤实验,MTT和流式细胞技术分别检测了DDEFL1被敲降后对细胞迁移能力,细胞生长增殖以及细胞周期分布的影响。 我们的RT-PCR和Western印迹研究显示,肝癌HepG2和肺腺癌H1299细胞有相当丰富的DDEFL1 mRNA和蛋白质表达。病毒感染实验显示,三个克隆的DDEFL1-shRNA重组腺病毒在HepG2和H1299细胞中不同程度地降低了感染细胞的DDEFL1 mRNA或蛋白质,其中以Ad3的敲降效果最为明显。与对照组相比,Ad3细胞感染在HepG2中导致DDEFL1 mRNA下降67%(P<0.002)蛋白下降61%(P<0.05),在H1299细胞中DDEFL1蛋白的表达下降了75%(P<0.05)。在正常的丰富培养基中,DDEFL1的敲降对HepG2和H1299细胞的生长和细胞周期分布没明显的影响。与此相比,DDEFL1的表达可能可以为低血清营养条件下的细胞生长提供有利条件。划痕损伤实验显示,与对照组相比,H1299和HepG2细胞感染Ad3之后细胞迁移能力都有明显的降低,但以H1299的作用效果更加明显。


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