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草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)产壳聚糖酶发酵条件及酶性质研究

朱利平  
【摘要】:本研究针对目前国内所报道的壳聚糖酶的酶活力普遍偏低、真正产酶量大且适用于工业化大规模生产的菌种很少、商品壳聚糖酶价格居高不下的问题,以得到具有工业化潜在应用价值的酶源为目标,开发海洋微生物资源,获取新颖的产壳聚糖酶的海洋真菌一株,对该菌所产壳聚糖酶进行了发酵条件、酶的纯化和酶学性质等方面的研究,为大规模微生物产壳聚糖酶的生产及其应用提供实验依据;具有很好的理论研究价值和实用意义。 通过研究得到如下实验结果: ⑴通过菌落的形态观察、电子显微镜观察和rDNA-ITS相结合的现代分子生物学方法等多项指标进行鉴定为:草酸青霉菌(Penicillium oxalicum),标记为:Penicillium oxalicum PCS-7。这是首次发现该菌具有产壳聚糖酶的能力。 ⑵对发酵产酶培养基进行优化:①采用寡营养培养基(蛋白胨9 g,葡萄糖10 g,壳寡糖10 g,pH 7.2,海水)进行发酵研究,发现Penicillium oxalicum在改良后的寡营养培养基中的生长量和产酶量基本不受营养条件贫瘠的影响;研究表明该菌发酵产酶所需培养基中可以直接利用海水而不必添加额外的无机盐成分,这样可以省掉在培养基中添加无机盐,同时可以减少发酵时所需的淡水消耗量,降低发酵培养基成本。②本研究进一步尝试多种廉价原料进行发酵产酶实验,结果表明:采用培养基成分(g/L):黄豆粉25 g,壳寡糖14 g,海水,pH值自然;在温度为25℃、摇床转速为150 rpm条件下,培养4 d,酶活力达到最大值为8.5 U/mL。本研究显示:可以利用黄豆粉海水培养基进行发酵产壳聚糖酶,该培养基的成本不足原发酵培养基的5%,大大降低了壳聚糖酶产生菌培养基的成本。 ⑶壳聚糖酶的纯化研究中发现,Penicillium oxalicum在采用黄豆粉培养基进行发酵的过程中,分泌胞外壳聚糖酶。发酵液经过冷冻离心后,胞外酶液即为相对较纯壳聚糖酶液;SDS-PAGE电泳检测该壳聚糖酶分子量为42 kDa。 ⑷酶学性质研究表明:酶适宜的反应条件:温度为50℃,pH值为6.0,添加Mg~(2+)、Mn~(2+)和Ca~(2+)对酶活性具有激活作用;具有较好的低温稳定性和较强的耐酸性;酶动力学参数:最大反应速度Vmax=0.05 mg/(mL·min),米氏常数Km=9.02 mg/mL。


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