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新型木聚糖酶及其Ca~(2+)依赖型碳水化合物结合模块的结构与功能

刘婷  
【摘要】:随着可利用的化石资源逐年减少,而人类对能源的需求越来越高,开发新型生物质能刻不容缓。木聚糖是半纤维素重要组成部分,其含量仅次于纤维素,是自然界中第二大丰富的多聚糖,占20%~30%。根据结构,木聚糖可分为β-1,4-木聚糖和β-1,3-木聚糖。而木聚糖酶在木聚糖的降解中起关键作用。故而,木聚糖酶的研究和应用将有助于利用生物资源,有望缓解能源短缺的问题。基于此,本论文主要开展以下工作:首先,从源于太平洋火色杆菌(Flammmeovirga pacifica)的β-1,3-木聚糖酶(Xyl3088)中鉴定了一种新型碳水化合物结合模块(CBM),该模块与已报道的CBM序列覆盖率为36.4%,同一性仅为25.0%。为了验证其功能,表达并纯化了截短的β-1,3-木聚糖酶(Xy13088-T)和碳水化合物结合模块(CBM3088)。与完整的β-1,3-木聚糖酶相比,Xy13088-T的热稳定性和催化效率(Kcat/K_m)均降低了90%,可见,该CBM对酶稳定性以及催化效率有显著影响。有趣的是,CBM3088仅在Ca~(2+)存在时才显示与β-1,3-木聚糖的结合能力,这与现已报道β-1,3-木聚糖酶中的CBM均不同,它对β-1,3-木聚糖的最大结合量为9.65μmol/g。通过生物信息学分析,初步揭示了Ca~(2+)与CBM3088及β-1,3-木聚糖的结合机制。这是β-1,3-木聚糖酶中Ca~(2+)依赖型CBM的首次报道。其次,鉴于β-1,3-木聚糖酶在利用海藻生产生物燃料和制备功能性低聚木糖中的重要作用,但却面临纯酶制备困难、成本高、重复使用率低、酶与产物分离困难等问题,尝试通过固定化酶技术解决这些问题。以本实验室所得的目前发现催化效率最高的β-1,3-木聚糖酶(Xyl3088)为对象,采用廉价的沥青为单体制备合成了HCP_(pitch)-CH_2–IDA负载镍为固定化载体,一步法实现酶分离纯化和固定化集成。β-1,3-木聚糖酶的酶活覆盖率为(80.66±0.87)%,固定化效率达到(90.01±1.05)%,固定化β-1,3-木聚糖酶在50℃时的半衰期为50.30分钟,显著高于游离酶的13.79分钟。固定化酶在30℃下保存80小时后具有65%的酶活,且重复使用15次后仍具有85%的初始酶活保留率。对于长颈蕨海葡萄的生物炼制,固定化酶在85小时后释放的还原糖比游离酶多30%,有望用于海藻生物炼制。再次,从太平洋火色杆菌Flammeovirga pacifica strain WPAGA1基因组,发现一条蛋白序列相似度与现有数据库收录的endo-β-1,4-木聚糖酶(Clostridium saccharobutylicum xynB,ID:P17137)约为60%的木聚糖酶Xyl4513。通过基因合成、构建质粒并表达,所得纯酶进行后续研究。结果表明:β-1,4-木聚糖酶(Xyl4513)具有2个保守结构域,该酶由一个属于糖苷水解酶11号家族(GH11)催化模块和一个属于CBM60家族的碳水化合物结合模块组成,这是一种比较罕见的G11家族木聚糖酶含有CBM的现象。纯化后的Xyl4513最适反应温度和pH值分别为30℃、3.0,这一反应特性说明Xyl4513是属于低温嗜酸β-1,4-木聚糖酶。分别构建截短的β-1,4-木聚糖酶(Xy14513-T)和碳水化合物结合模块(CBM4513)表达载体,分离纯化后发现Xyl4513-T最适反应温度和pH值分别为20℃、4.0,且催化效率(Kcat/K_m)下降了20%。Ca~(2+)、Mg~(2+)、Ni~(2+)和EDTA对两个酶的催化活性均有明显促进作用,其中Ca~(2+)的效果更为明显。当含有20 mmol/L Ca~(2+)时,CBM4513对β-1,4-木聚糖具有特异性结合能力,最大结合量为9.13μmol/g,证明了CBM4513是一种Ca~(2+)依赖型碳水化合物结合模块。最后,采用酶解法水解β-1,3-木聚糖,通过薄层层析(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)分析β-1,3-低聚木糖的组成,并测定了其中寡糖的生物学活性。结果表明:木二糖和木三糖是酶解生成的β-1,3-低聚木糖中具有主要活性的成分;在四种体外抗氧化体系中,β-1,3-低聚木糖的抗氧化能力在浓度0.25-2 mg/mL内均呈现良好的量效关系。在·OH自由基清除实验中,0.25 mg/ml Vc和β-1,3-低聚木糖时,清除率分别为68.01%和78.03%,1.5 mg/mL时,清除率分别为99.91%和95.45%,而β-1,4-低聚木糖在2 mg/mL时的清除率仅有5.47%。这说明1,3-木寡糖的抗氧化能力显著高于1,4-木寡糖。而采用CCK8法定性的检测β-1,3-低聚木糖对人乳腺癌细胞MCF-7的抑制作用,结果表明在浓度300-1000μg/mL,时间24-72小时,随着浓度越高,孵化时间越长,对MCF-7活性的抑制效果越好。本研究成功表达验证了一个新型β-1,4-木聚糖酶和两个新型Ca~(2+)依赖型碳水化合物结合模块,并借助生物信息学等手段初步阐释了其作用机制。此外,通过固定化技术提高了酶的稳定性和重复利用率,最后通过酶解法制备功能性β-1,3-低聚木糖,为生物燃料和海藻的开发利用提供了更丰富的选择。


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